林思思，王舒儀，孫旺，施更生

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院 口腔科，浙江 臺州 317000）

口腔鱗癌是亞洲人頭頸部腫瘤中最常見的腫瘤之一[1]，雖然近幾十年來其治療手段不斷增加，包括放化療的應(yīng)用，使得口腔鱗癌的治療不再局限于手術(shù)切除，但是由于局部侵襲和早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點，其治療效果仍不太理想，且5年生存率只有50%左右[2]。因此，口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制及尋求腫瘤中特定的分子標志物以便能早期確診和早期治療已成近年來研究的熱點。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transitions，EMT）與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移侵襲有密切聯(lián)系，即在某種特定情況下，腫瘤上皮細胞會發(fā)生一系列變化，會失去上皮細胞的特性而獲得間質(zhì)細胞移動的能力[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中EMT的發(fā)生往往伴隨著腫瘤細胞從原發(fā)部位沿血管、淋巴管等途徑向其他部位繼續(xù)生長[4]，EMT的過程受多種細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和Slug均參與其中[3]。E-cadherin是跨膜轉(zhuǎn)運糖蛋白家族中的一員，與鈣依賴性的細胞黏附有關(guān)，在胚胎發(fā)育和器官形成中起重要作用[5]，Vimentin作為中間絲纖維蛋白家族成員，參與構(gòu)成細胞骨架，主要由間質(zhì)來源的細胞表達，其在正常上皮細胞中不表達，因此Vimentin可作為EMT的分子標志物。Slug是Snail鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，與原腸胚形成和中胚層形成有關(guān)，同時還涉及細胞分化、細胞移動和細胞凋亡[6-8]。本研究通過對Tca8113細胞轉(zhuǎn)染Slug過表達質(zhì)粒，觀察Slug過表達對口腔鱗癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響，從而為臨床篩選藥物提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 口腔鱗癌細胞株Tca8113細胞來源于臺州醫(yī)院恩澤公共科研平臺，GV141/Slug和GV141質(zhì)粒購自上海吉凱基因科技有限公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天科技有限公司，RMPI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，Trizol裂解液購自日本TAKARA公司，F(xiàn)S SYBR Green Master購自上海Rocge公司，Revert Aid Firat Strand cDNA Synthesia Kit購自美國Femrengtas公司，引物購自上海生工生物技術(shù)有限公司，兔抗人Slug單抗和Vimentin單抗購自美國CST公司，兔抗人E-cadherin多克隆抗體購自美國Abcam公司，二抗羊抗兔購自美國Biosharp公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染口腔鱗癌Tca8113細胞：口腔鱗癌Tca8113接種于6孔板，溫箱培養(yǎng)24 h細胞貼壁匯合度達到80%～90%時，用lipofectamine6000轉(zhuǎn)染。將細胞分為3組：空白對照組（Control組）細胞不加質(zhì)粒載體；轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒組，即GV141/Slug組；轉(zhuǎn)染空載體組，即GV141組。將3組細胞培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)有無熒光表達。

1.2.2 熒光定量PCR檢測：將3組貼壁細胞消化離心后，裂解，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，采用SYBR Green嵌合熒光定量PCR法，以GADPH為內(nèi)參檢測3組細胞Slug、E-cadherin和Vimentin mRNA的含量，其中20 μL反應(yīng)體系為：1 μL cDNA、0.25 μL上游引物、0.25 μL下游引物、8.5 μL ddH2O、10 μL SYBR Green Q-PCR Supermix，反應(yīng)條件為：預(yù)變性50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，循環(huán)階段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，該反應(yīng)在實時熒光定量儀ABI7500上進行。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 Western blot檢測：將轉(zhuǎn)染后的3組細胞溫箱培養(yǎng)48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用PBS配制的5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，將封閉過的PVDF膜稍微瀝干后，放入干凈的雜交袋，以Slug和Vimentin的一抗比例為1∶1 000，E-cadherin以1∶10 000的比例，4 ℃搖床過夜，隔天PVDF膜用10% PBST漂洗，放入1∶10 000的羊抗兔二抗，室溫搖動1～2 h，洗膜，ECL顯色，應(yīng)用ImageJ對Western blot結(jié)果的灰度值進行分析。

1.2.4 細胞劃痕實驗：將轉(zhuǎn)染后的3組細胞培養(yǎng)48～72 h，待細胞長滿6孔板，用槍頭比著直尺，垂直劃痕，用PBS清洗細胞3遍，加入無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱，按0、6、12、24 h取樣拍照。

1.2.5 Transwell實驗：取Transwell小室放入24孔板中，基質(zhì)膠鋪板，水化，將細胞懸液中的細胞以1×105的密度按每孔200 μL分別接種于Transwell膜上，并在小室下方每孔加600 μL含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去小室膜內(nèi)表面的細胞和基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定，考馬斯藍染色，每孔設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，顯微鏡下觀察穿過基質(zhì)膠膜底的細胞數(shù)，以穿過膜底的細胞數(shù)來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率的檢測 細胞培養(yǎng)24 h后，GV141/Slug和GV141組細胞均可見綠色熒光，表明質(zhì)粒均已轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染率為50%～60%。見圖1。

圖1 GV141/Slug組和GV141組細胞轉(zhuǎn)染后觀察到的熒光（×40）

2.2 3組細胞中Slug mRNA的表達 GV141組與Control組比Slug mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.363）；GV141/Slug組與GV141組比Slug mRNA表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）。見圖2。

圖2 3組細胞中Slug mRNA的相對表達量

2.3 3組細胞中Slug蛋白表達 GV141組與Control組比Slug蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.492）；GV141/Slug組與GV141組比Slug蛋白相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.026）。見圖3。

圖3 3組細胞中Slug蛋白的相對表達量

2.4 3組細胞中E-cadherin和Vimentin mRNA的表達量 GV141組與Control組比E-cadherin mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.631）；GV141/Slug組與GV141組比E-cadherin mRNA表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.042）。GV141組與Control組比Vimentin mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.746）；GV141/Slug組與GV141組比Vimentin mRNA表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.031）。見圖4。

圖4 E-cadherin和Vimentin mRNA在3組細胞中的相對表達量

2.5 3組細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白的相對表達量 GV141組與Control組比E-cadherin蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.902）；GV141/Slug組與GV141組比E-cadherin蛋白相對表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.013）。GV141組與Control組比Vimentin蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.882）；GV141/Slug組與GV141組比Vimentin蛋白相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.025）。見圖5。

2.6 劃痕實驗結(jié)果 GV141組細胞在24 h后的愈合距離與Control組細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.463）；GV141/Slug組細胞在24 h后的愈合距離與GV141組細胞比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。見圖6。

2.7 Transwell實驗結(jié)果 GV141組細胞24 h穿過小室的細胞數(shù)與Control組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.951），GV141/Slug組細胞24 h穿過小室的細胞數(shù)較GV141組增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.042）。見圖7-8。

圖5 E-cadherin和Vimentin蛋白在3組細胞中的相對表達量

圖6 3組細胞24 h愈合的距離

圖7 3組細胞24 h穿過小室的細胞數(shù)（×40）

3 討論

口腔鱗癌預(yù)后較差，局部侵襲和淋巴結(jié)的遠處轉(zhuǎn)移是不利于口腔鱗癌預(yù)后的重要因素[9]，因此，抑制腫瘤細胞的局部侵襲和淋巴結(jié)的遠處轉(zhuǎn)移成為提高口腔鱗癌預(yù)后效果的關(guān)鍵，但是目前研究仍未尋找出有效的機制。最近研究表明腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移與EMT密切相關(guān)[10]，在某些因素的調(diào)節(jié)下，上皮細胞會向間質(zhì)細胞的方向改變，包括細胞形態(tài)、細胞結(jié)構(gòu)、細胞間的黏附能力和細胞遷移能力等[11]。E-cadherin作為上皮細胞的黏附分子，由CDH1基因編碼，通過細胞外結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的鈣依賴性地與細胞間黏附，它的結(jié)構(gòu)域包括5個鈣黏蛋白重復(fù)、1個跨膜結(jié)構(gòu)域以及1個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[12]。在EMT的過程中，E-cadherin的含量降低時，細胞的轉(zhuǎn)移能力增強，腫瘤細胞的侵移能力增強[13]，因此E-cadherin表達缺失與腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Vimentin可作為EMT的分子標志物之一，已被證實在多種惡性腫瘤如低分化前列腺癌、乳腺癌等中高表達，并且這種高表達與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力密切相關(guān)。Slug作為鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，有高度保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，是EMT的重要標志物，在具有高度侵襲性的腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)，與胃癌[14]、胸腺瘤[15]等腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，而Slug在許多惡性腫瘤中的表現(xiàn)與E-cadherin蛋白的表現(xiàn)相反，多呈上調(diào)的趨勢[15-16]。

圖8 3組細胞24 h穿過小室的細胞數(shù)

研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Slug可抑制E-cadherin基因的表達。SHENG等[17]通過轉(zhuǎn)染cDNA發(fā)現(xiàn)在未分化甲狀腺癌中Slug可抑制E-cadherin基因的表達，為未分化甲狀腺癌的靶向治療提供了實驗依據(jù)。HAJRA等[18]通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中Slug可通過識別結(jié)合E-cadherin啟動子中的E-box元件來抑制E-cadherin基因的表達。XIE等[19]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，Slug基因可通過p19Arf來抑制E-cadherin的表達。而目前國內(nèi)關(guān)于EMT、Slug和E-cadherin在口腔鱗癌中的研究仍然較少，鄭彩云等[20]從蛋白層面，王舒儀等[21]從基因?qū)用娣謩e研究證明在口腔鱗癌細胞中Slug可調(diào)控E-cadherin，參與了EMT的發(fā)展，但體外研究仍較少見。

本研究選用口腔鱗癌Tca8113細胞為研究對象，構(gòu)建帶熒光使Slug基因過表達的質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒，并設(shè)置空白對照組，將目的質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別用Lipo6000轉(zhuǎn)入細胞中，通過檢測Slug mRNA和蛋白的表達情況來檢測轉(zhuǎn)染效率，并檢測EMT相關(guān)的E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達量，最后用劃痕實驗和Transwell實驗來檢測Slug基因過表達對口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Slug過表達質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒的Tca8113細胞均可觀察到綠色熒光，其表達率在50%～60%，且轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的Tca8113細胞其E-cadherin的mRNA和蛋白表達量較其他2組明顯減少，與此同時，該細胞組轉(zhuǎn)移和侵襲能力較其他2組有所增強。這一研究結(jié)果和在其他腫瘤中的發(fā)現(xiàn)相同，即Slug基因與E-cadherin基因存在負相關(guān)，并且本研究發(fā)現(xiàn)Slug基因高表達可促使EMT的發(fā)生。為更加完善進一步了解，未來還應(yīng)探求在口腔鱗癌中調(diào)控Slug的相關(guān)機制及Slug誘導(dǎo)EMT發(fā)生的相關(guān)通路研究，以便早期抑制Slug基因的表達，阻斷EMT發(fā)展，開展口腔鱗癌靶向治療。