張明曉，黃陸平，金深輝，陳思佳，戴勤學

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）為晚期炎癥反應介質(zhì)，由單核細胞或巨噬細胞在炎癥反應中主動分泌[1-2]。丙泊酚作為一種新型靜脈麻醉藥，因其起效快、蘇醒迅速而完全、不良反應少、持續(xù)輸注后無蓄積等特點，己廣泛應用于臨床各科的手術(shù)麻醉[3-4]。近年來報道丙泊酚具有腦保護作用，而炎癥是腦損傷中的關(guān)鍵因素[5-6]。越來越多的研究已證實丙泊酚的炎癥調(diào)控作用[5，7-8]，但其對HMGB1的調(diào)控作用尚未完全闡明。p38 MAPK信號通路是細胞內(nèi)應激反應信號，其表達廣泛，與炎癥反應密切相關(guān)[9-10]。已有研究證實，丙泊酚能通過抑制HMGB1的表達調(diào)控LPS誘導的炎癥反應，緩解大鼠急性肺損傷[1]。p38信號通路也可調(diào)控TNF-α誘導的HMGB1表達[11]。我們推測丙泊酚能通過p38 MAPK信號通路抑制TNF-α誘導的HMGB1表達，本研究應用TNF-α誘導小膠質(zhì)細胞炎癥反應模型，驗證丙泊酚對HMGB1的調(diào)控作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料 小膠質(zhì)BV-2細胞（中國科學院基礎醫(yī)學細胞中心）。丙泊酚、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）購自美國Sigma公司；HRP標記山羊抗兔IgG/鼠IgG、p-p38鼠單克隆抗體、p38鼠多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；抗GAPDH兔單克隆抗體購自德國CST公司；HMGB1鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司；RNA提取試劑購自大連Takara公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜與曝光系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司；SpectraMax M2型酶標儀購自美國Molecular Devices公司；倒置及正置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 小膠質(zhì)BV-2細胞培養(yǎng)：將小膠質(zhì)BV-2細胞接種到DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清）中培養(yǎng)傳代2次取生長良好的細胞用于實驗研究。

1.2.2 不同濃度丙泊酚及TNF-α處理細胞：不同濃度丙泊酚（5、10、20、50、100、150和200 μmol/L）處理小膠質(zhì)細胞24 h后，MTT法檢測各濃度對小膠質(zhì)細胞增殖的影響，選擇合適濃度的丙泊酚進行后續(xù)實驗。不同濃度（5、10和20 ng/mL）的TNF-α處理細胞后進行RT-qPCR和Western blot檢測HMGB1的mRNA及蛋白表達。

1.2.3 分組：將小膠質(zhì)BV-2細胞分組，設立對照組、TNF-α（20 ng/mL）組、TNF-α（20 ng/mL）+丙泊酚（10、20、50 μmol/L）組，丙泊酚孵育細胞1 h后再經(jīng)TNF-α處理6、24 h，收集細胞進行RT-qPCR和Western blot檢測HMGB1的表達和p38的磷酸化；將小膠質(zhì)BV-2細胞分組，設立對照組、TNF-α（20 ng/mL）組、sip38組、TNF-α（20 ng/mL）+sip38組、TNF-α（20 ng/mL）+丙泊酚（50 μmol/L）組、TNF-α（20 ng/mL）+sip38+丙泊酚（50 μmol/L）組，小膠質(zhì)BV-2細胞經(jīng)p38的siRNA（10 nmol/L）處理12 h后再經(jīng)丙泊酚孵育1 h，最后用TNF-α處理細胞6、24 h，收集細胞進行RT-qPCR和Western blot檢測HMGB1的表達。

1.2.4 RNA的提取與RT-qPCR檢測：細胞研磨后，加入1 mL提取試劑，收集到1.5 mL EP管，加入200 mL氯仿，渦旋15 s，室溫靜置5 min，12 000×g離心，15 min，4 ℃，吸出無色上層液到另一EP管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10 min，12 000×g離心10 min，4 ℃，去上清，加入1 mL 75%乙醇，7 500×g離心，5 min，4 ℃。去上清，吸出液體，室溫干燥10 min，加入DEPC水溶解RNA，測量RNA的純度（OD260/OD280）及濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒用隨機六聚體引物和轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。獲得的cDNA通過RT-qPCR分析檢測HMGB1 mRNA的表達水平，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列（5’-3’）

1.2.5 Western blot檢測細胞HMGB1、p38和p-p38的表達：細胞裂解后，測蛋白濃度并配平每個蛋白的上樣量。等量蛋白通過SDS膠進行分級分離，然后濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，相對分子質(zhì)量小的用0.2 μm孔徑的膜，相對分子質(zhì)量大的用0.45 μm孔徑的膜。90 min后用5%脫脂牛奶進行封閉，待封閉好后加入一抗（HMGB1鼠單克隆抗體、p-p38鼠單克隆抗體、p38鼠多克隆抗體和抗GAPDH兔單克隆抗體，均稀釋為1∶1 000），置室溫搖床孵育2 h之后移至4 ℃搖床過夜。次日加入HRP結(jié)合的二抗（1∶3 000），二抗孵育1 h后用TBST洗滌3次。加ECL液避光孵育2 min，曝光儀成像。

1.2.6 siRNA誘導的基因沉默：利用特異性siRNA序列實現(xiàn)細胞內(nèi)的基因沉默，小鼠p38特異性siRNA購買自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。采用LipofectAMINETM2000（美國Invitrogen公司）將10 nmol/L的siRNA轉(zhuǎn)染至小膠質(zhì)BV-2細胞，具體操作根據(jù)說明書指示進行。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，2組間比較采用student’s t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析并以Bonferroni校正作后比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低劑量丙泊酚不影響小膠質(zhì)細胞增殖 150和200 μmol/L丙泊酚可明顯抑制小膠質(zhì)細胞增殖（P＜0.01），見圖1。表明高濃度丙泊酚對小膠質(zhì)細胞有著細胞毒性作用，可能會影響后續(xù)研究，所以后續(xù)實驗只使用10、20和50 μmol/L濃度的丙泊酚。

圖1 MTT法檢測不同濃度丙泊酚對小膠質(zhì)BV-2細胞增殖作用的影響

2.2 TNF-α劑量依賴性地上調(diào)小膠質(zhì)細胞HMGB1表達 與對照組比，不同濃度（5、10和20 ng/mL）的TNF-α組HMGB1 mRNA表達均明顯增高（P＜0.05），10和20 ng/mL的TNF-α組HMGB1蛋白表達明顯升高（P＜0.05），且TNF-α濃度越高，HMGB1表達越高，見圖2。表明TNF-α可上調(diào)小膠質(zhì)細胞HMGB1的表達，后續(xù)實驗采用20 ng/mL濃度的TNF-α。

2.3 丙泊酚降低TNF-α誘導的小膠質(zhì)細胞HMGB1的表達 經(jīng)TNF-α處理后HMGB1蛋白和mRNA表達明顯增高（P＜0.01），而與TNF-α組比，10、20和50 μmol/L丙泊酚預處理顯著降低HMGB1蛋白和mRNA表達（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量越高，抑制效果越明顯的趨勢，見圖3。

圖2 不同濃度TNF-α對小膠質(zhì)BV-2細胞HMGB1蛋白（A）和mRNA（B）表達的影響

2.4 丙泊酚通過抑制p38激活降低TNF-α誘導小膠質(zhì)細胞HMGB1的表達 后續(xù)對丙泊酚調(diào)控TNF-α誘導小膠質(zhì)細胞HMGB1表達的機制研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比，TNF-α組p38的磷酸化水平明顯增高（P＜0.01），而丙泊酚處理后，p38的磷酸化顯著降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性（見圖4A）。利用siRNA沉默p38的表達后，再用丙泊酚處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默p38可抑制TNF-α誘導的HMGB1蛋白和mRNA表達升高（P＜0.01），而丙泊酚（50 μmol/L）處理后，sip38+丙泊酚組與si p38組HMGB1蛋白和mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4B-C；表明丙泊酚可能通過抑制p38激活降低TNF-α誘導小膠質(zhì)細胞HMGB1的表達。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷后，小膠質(zhì)細胞介導的慢性神經(jīng)炎癥反應會損傷局部腦組織，加重病情，不利于神經(jīng)功能的恢復[12-13]。丙泊酚被報道在缺血性腦損傷中有著保護作用[6，14]，但其對腦損傷的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能鮮有報道。

丙泊酚作為麻醉藥，如果用量過大對細胞也必然會產(chǎn)生影響[15-16]。在研究丙泊酚對小膠質(zhì)細胞HMGB1調(diào)節(jié)作用的過程中，當濃度增加到150 μmol/L時，丙泊酚便顯示出明顯的細胞毒性作用。因此，后續(xù)實驗選取了較低濃度（5～100 μmol/L）的丙泊酚做進一步的研究。

圖3 丙泊酚對TNF-α誘導小膠質(zhì)BV-2細胞HMGB1蛋白（A）和mRNA（B）表達的影響（TNF-α濃度為20 ng/mL）

HMGB1作為一種細胞因子[17]，其作用是雙方面的。一方面它可以引起骨髓細胞的轉(zhuǎn)移，促進表皮細胞的再生；另一方面也會參與自身炎癥反應和敗血癥等[18]。HMGB1與TNF-α、IL-1等早期速發(fā)型炎性因子不同，TNF-α和IL-1等作為一種促炎性因子在早期炎癥中發(fā)揮重要作用，而HMGB1作為介導LPS所致細胞死亡的細胞因子，其產(chǎn)生較晚，且持續(xù)時間長，因此被認為是一種重要的晚期炎癥反應介質(zhì)，可在炎癥反應中被單核細胞或巨噬細胞表達與分泌，與此同時早期速發(fā)型炎性因子與HMGB-1的表達及分泌密切相關(guān)[11]。HMGB1在炎癥物質(zhì)如LPS等刺激下由固有免疫細胞分泌，這些介質(zhì)又能夠加強HMGB1的分泌效應，形成一個復雜的細胞因子分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡。HMGB1是決定特定細胞壞死或凋亡的關(guān)鍵信號，細胞釋放出HMGB1引起晚期炎癥反應即可誘導細胞死亡，而凋亡細胞即使經(jīng)受第二次壞死或部分自溶也不會釋放HMGB1而誘發(fā)死亡[18]。在膿毒癥中，在LPS誘導晚期炎癥反應中，HMGB1可分泌出胞，加劇炎癥級聯(lián)瀑布反應，導致細胞死亡，由此可見HMGB1在炎癥反應中的重要性與致死性毒性[17]。本研究主要探究HMGB1在腦損傷炎癥晚期（TNF-α誘導）中的表達。本研究檢測了不同濃度TNF-α對小膠質(zhì)細胞HMGB1 mRNA水平和蛋白水平的影響。結(jié)果表明：與對照組相比，20 ng/mL的TNF-α可明顯增強小膠質(zhì)細胞HMGB1蛋白和mRNA表達。而10、20和50 μmol/L的丙泊酚預處理組與TNF-α組相比較，HMGB1蛋白和mRNA水平明顯降低，且呈劑量依賴性。所以，丙泊酚可抑制TNF-α誘導小膠質(zhì)細胞的HMGB1表達。

圖4 丙泊酚通過p38調(diào)控HMGB1的表達

有研究報道TNF-α可通過p38的激活誘導HMGB1的表達[11，19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組比，20 ng/mL TNF-α可明顯增強小膠質(zhì)細胞p38的激活，而丙泊酚處理可明顯抑制p38激活，且呈現(xiàn)劑量依賴性。另sip38轉(zhuǎn)染實驗表明：與對照組比，sip38可明顯抑制TNF-α誘導小膠質(zhì)細胞HMGB1的表達，而丙泊酚處理后，并未出現(xiàn)明顯差異，說明抑制p38的表達后丙泊酚無法實現(xiàn)對HMGB1的調(diào)控作用。

綜上所述，小膠質(zhì)細胞受TNF-α干預后，p38 MARK被激活及HMGB1表達升高，丙泊酚處理后，可顯著降低TNF-α誘導的小膠質(zhì)細胞p38的激活及HMGB1 mRNA和蛋白的表達。而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進一步實驗發(fā)現(xiàn)丙泊酚對HMGB1的調(diào)控作用是通過p38實現(xiàn)[20]。由此可見，丙泊酚在腦損傷免疫炎癥系統(tǒng)中的調(diào)控作用可能是通過其對p38/HMGB1的調(diào)控作用實現(xiàn)的。