肖靖杰，張治平，王洋，司超，張亮，張偉，李麗，李新芝，馬克濤

[1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，新疆 石河子832003；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻喉科，新疆 石河子 832008；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 老干二科，新疆 石河子 832008；4.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），新疆 石河子832003]

有研究表明，血管平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cells, SMCs）增殖、遷移及黏附等功能的變化在腦卒中、缺血缺氧性耳聾和Meniere綜合癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色[1-6]。因此，建立一種簡單而高效的腦血管SMCs的培養(yǎng)方法對研究上述疾病的發(fā)病機(jī)制有重要意義。腦基底動(dòng)脈細(xì)小，分離困難，直接貼壁法操作難度大，成功率低，而酶消化法的時(shí)間和濃度不易掌握[7-8]。本實(shí)驗(yàn)在參照國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，最終聯(lián)合應(yīng)用這2種常用的方法，培養(yǎng)出大量腦基底動(dòng)脈SMCs，經(jīng)鑒定，其純度高，生長狀況良好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豚鼠約2周齡，體重145～185 g，雌雄不限，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物使用許可證批號：SCXK新（2003-0001），動(dòng)物質(zhì)量符合一級標(biāo)準(zhǔn)。飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格遵守《石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會條例》。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購自美國Hyclone公司，平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SM-actin）抗體（英國abcam公司）、β-actin一抗和二抗、即用型鏈霉親和素-生物素復(fù)合物試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine, DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，牛血清蛋白（bovine serum albumin, BSA）（美國Blotopped公司），碘化丙啶（propidium iodide, PI）（北京索萊寶科技有限公司），磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）、Triton-x-100購自上海生工生物工程股份有限公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），倒置相差顯微鏡（美國Motic公司），激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司），電泳儀、電轉(zhuǎn)膜儀、GEL-DOC2000凝膠成像儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 豚鼠3只，麻醉后斷頭處死，無菌條件下迅速取出全腦，分離出腦基底動(dòng)脈并小心去除血管周圍的結(jié)締組織。將分離出的動(dòng)脈放入預(yù)冷不含Ca2+和Mg2+的Hank’s液中，漂洗2、3次，移入無菌臺操作。

將基底動(dòng)脈移入裝含Hank’s液的培養(yǎng)皿中，剪成3～5 mm的片段，將血管片段放入濃度為0.125%的胰蛋白酶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中消化20 min，每隔5 min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，并輕輕吹打3、4次，消化完成后，立即終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。剩余血管片段加入幾滴含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，輕輕混勻，均勻鋪在培養(yǎng)皿中。血管片段間隙2～3 mm，培養(yǎng)皿倒扣置于培養(yǎng)箱中2 h。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱中，靜置3 d。第3天進(jìn)行首次換液，第6～8天可見細(xì)胞由組織邊緣長出，約2周時(shí)長滿培養(yǎng)皿，并進(jìn)行首次傳代。

1.2.2 細(xì)胞傳代 當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時(shí)，可進(jìn)行傳代[9]。棄培養(yǎng)基，PBS洗2、3遍，取濃度為0.25%的胰蛋白酶（含0.02%乙二胺四乙酸）進(jìn)行消化，鏡下可見細(xì)胞邊緣折光增強(qiáng)，成片皺縮變圓且細(xì)胞間隙逐漸變大。當(dāng)見細(xì)胞大部分脫落時(shí)立即終止消化，并夾棄較大的血管片段，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，分別移入2個(gè)新的35 mm培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞純化 由于腦基底動(dòng)脈直徑小，不容易去除內(nèi)膜和外層的纖維層，所以在細(xì)胞傳代的過程中，根據(jù)成纖維細(xì)胞和SMCs不同的貼壁時(shí)間，采用自然純化法和差異貼壁法對細(xì)胞進(jìn)行純化。成纖維細(xì)胞的貼壁能力大于SMCs，而SMCs的貼壁能力大于內(nèi)皮細(xì)胞[10]。同時(shí)，由于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)條件較嚴(yán)格，在上述條件下無法存活[11]。因此在傳代時(shí)，根據(jù)上述規(guī)律，首先將細(xì)胞懸液移入35 mm培養(yǎng)皿中，靜置30 min，使部分細(xì)胞貼壁，然后吸取上層細(xì)胞懸液移入另一個(gè)新的培養(yǎng)皿中，再次靜置30 min，最后吸取第2個(gè)皿中的細(xì)胞懸液移入第3個(gè)培養(yǎng)皿中，收集第3個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞即可獲得較純的平滑肌細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞鑒定 ①形態(tài)學(xué)觀察：應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察并拍照記錄細(xì)胞的大小、形態(tài)、生長方式及肌絲排列特點(diǎn)等。②免疫熒光染色：取第4代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，均勻種植到放置玻片的6孔板中，使細(xì)胞爬片。3 d后，棄培養(yǎng)基，37℃預(yù)溫的PBS洗3次，5 min/次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，0.2% Triton-x-100透化細(xì)胞3 min，PBS洗3次，在含5% BSA的37℃恒溫箱封閉30 min，PBS洗3次。加入一抗α-SM-actin（1∶300），濕盒置入4℃冰箱中過夜。次日，37℃恒溫箱復(fù)溫30 min，PBS洗3次。暗室中，加入二抗（1∶50），37℃恒溫孵育1 h，PBS洗3次，PI染核，抗熒光淬滅劑封片，用激光共聚焦顯微鏡采集圖像，分析結(jié)果。③免疫組織化學(xué)法染色：細(xì)胞爬片，透化，3% H2O2-甲醇封閉5 min，PBS洗3次。加入α-SM-actin，4℃過夜。PBS洗3次，滴加二抗類似物（山羊抗兔IgG/HRP聚合物），37℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，自來水反藍(lán)，中性樹膠封片，收集圖像。④Western blot檢測：收集細(xì)胞，裂解并提取總蛋白質(zhì)，BCA法測蛋白濃度。加入適量上樣緩沖液煮沸，凍存?zhèn)溆谩２捎镁郾０纺z電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5% BSA封閉2 h，加入α-SM-actin（1∶1 000），4℃過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20, TBST）洗膜，二抗（1∶20 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜，于暗室中滴加發(fā)光試劑，壓片、顯影、定影，采集圖像后用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

腦基底動(dòng)脈血管片段貼于培養(yǎng)皿6 d后，約85%組織塊存活，鏡下可觀察到大量細(xì)胞從組織塊邊緣游離出來（見圖1A）；至10 d左右，隨著細(xì)胞的增殖，培養(yǎng)皿內(nèi)可見大量平行生長的細(xì)胞；18 d左右可見細(xì)胞鋪滿皿底（見圖1B）。細(xì)胞大小形態(tài)不一，呈梭形、三角形或帶狀，有長短不一的胞突，胞質(zhì)豐富，胞核呈卵圓形，居中，部分可見雙核甚至多核。細(xì)胞密度較低時(shí)，常交織成網(wǎng)狀，而培養(yǎng)至22 d左右，細(xì)胞密度較高，呈螺旋狀或柵欄狀，表現(xiàn)為典型的“峰-谷”樣生長（見圖1C）。利用細(xì)胞的生長特點(diǎn)進(jìn)行反復(fù)純化，平滑肌細(xì)胞的純度越來越高，第4代后細(xì)胞純度＞95%。

圖1 腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長過程 （×100）

2.2 平滑肌細(xì)胞的鑒定結(jié)果

2.2.1 免疫熒光染色鑒定結(jié)果 取第4代細(xì)胞，爬片后經(jīng)平滑肌細(xì)胞特異的肌動(dòng)蛋白（α-SM-actin）抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示肌動(dòng)蛋白陽性表達(dá)率達(dá)95%（見圖2A）。經(jīng)PI染核，胞核呈紅色（見圖2B）。圖2C為圖2A和圖2B合并。

2.2.2 免疫組織化學(xué)法染色鑒定結(jié)果 取第4代細(xì)胞，爬片后經(jīng)肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色，鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)含大量棕黃色顆粒，呈線性排列且與細(xì)胞長軸平行，細(xì)胞核呈卵圓形，居中。（見圖3）。

2.2.3 平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá) 收集第4代細(xì)胞，裂解并提取總蛋白，Western blot檢測平滑肌特異性的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示肌動(dòng)蛋白呈陽性表達(dá)。見圖4。

圖2 平滑肌細(xì)胞 （免疫熒光染色×200）

圖3 平滑肌細(xì)胞中α肌動(dòng)蛋白絲 （免疫組織化學(xué)法）

圖4 平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的表達(dá)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦卒中、缺血缺氧性耳聾及Meniere綜合征等疾病的重要病因。近年來研究顯示，顱內(nèi)、外動(dòng)脈粥樣硬化可能具有不同的危險(xiǎn)因素和發(fā)病機(jī)制[12]。SMCs是血管中膜的主要組成成分，當(dāng)血管發(fā)生損傷時(shí)，SMCs可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從靜息態(tài)的收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)樵錾鷳B(tài)的合成表型，重新獲得向內(nèi)膜遷移、增殖的能力。同時(shí)，血管SMCs表型轉(zhuǎn)化引發(fā)的增殖、遷移及黏附等功能變化為腦動(dòng)脈粥樣硬化、術(shù)后再狹窄等病理演變過程中的共同特征。

眾所周知，耳蝸螺旋動(dòng)脈是供應(yīng)耳蝸血流的唯一動(dòng)脈，其上游依次是小腦前下動(dòng)脈和腦基底動(dòng)脈，且耳蝸螺旋動(dòng)脈側(cè)枝循環(huán)較少，一旦發(fā)生堵塞，不易代償，可造成耳蝸微循環(huán)的障礙及病理性的損害。因此，一方面，腦基底動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化是造成缺血性腦卒中的重要因素；另一方面，腦基底動(dòng)脈和耳蝸螺旋動(dòng)脈的血流供應(yīng)對維持正常聽力十分重要。

就培養(yǎng)顱內(nèi)動(dòng)脈SMCs而言，多取材于牛、豬、犬、兔等較粗大的腦血管，而對于豚鼠，其腦基底動(dòng)脈細(xì)小，分離困難。由于目前缺乏簡單、經(jīng)濟(jì)的SMCs培養(yǎng)方法，大大制約對其相關(guān)病理生理變化的研究。本實(shí)驗(yàn)詳細(xì)描述腦基底動(dòng)脈的分離，原代細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及鑒定方法，從而建立一種簡單經(jīng)濟(jì)、高效的腦基底SMCs培養(yǎng)方法。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6 d左右組織塊邊緣有SMCs游離出來，18 d左右可鋪滿皿底，第3代即可得到較純的SMCs。經(jīng)鑒定，在形態(tài)上，細(xì)胞呈典型的“峰-谷”樣生長。經(jīng)免疫熒光和免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果顯示，第4代細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白陽性表達(dá)率達(dá)95%，而Western blot檢測結(jié)果亦同樣顯示肌動(dòng)蛋白呈陽性表達(dá)。

SMCs培養(yǎng)過程中最大的問題就是細(xì)胞的純化，即如何去除混雜在其中的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道，酶消化法和組織貼塊法是培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞最常用的2種方法[7-8]。雖然酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞周期較短，但是消化酶作用的時(shí)間和濃度不易掌握，且酶本身對細(xì)胞就有一定的毒性作用；相比較而言，組織貼塊法操作簡便，不易發(fā)生污染，但培養(yǎng)周期較長。微小動(dòng)脈的血管由3層細(xì)胞組成：外層的成纖維細(xì)胞，中間層的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞。培養(yǎng)大血管SMCs時(shí)，可以通過機(jī)械刮除的方式去除成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，但腦基底動(dòng)脈較細(xì)小，不宜采用上述方式。經(jīng)過嘗試，本實(shí)驗(yàn)最終選擇將2種方法聯(lián)合使用。

實(shí)驗(yàn)中有以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟需要注意：①選擇動(dòng)物時(shí)，由于豚鼠具有與人類類似的耳蝸解剖結(jié)構(gòu)，在相同條件下，年幼豚鼠的組織塊較年長豚鼠有更好的增殖潛能，在保證組織足夠的情況下，本實(shí)驗(yàn)選用約2周齡的新生豚鼠；②分離腦基底動(dòng)脈時(shí)動(dòng)作一定要輕柔，避免對血管過度牽拉造成損傷；③細(xì)胞生長具有密度依賴性，組織塊以1 mm×1 mm為宜，間距2～3 mm，以保證細(xì)胞有足夠的生長空間，且能保持合適的生長密度；④組織貼塊時(shí)，培養(yǎng)皿倒扣的時(shí)間為2 h，時(shí)間過短貼壁不牢，過長則會導(dǎo)致組織塊干涸；⑤原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)選用含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，血清濃度過低會降低培養(yǎng)的成功率，而傳代培養(yǎng)時(shí)，開始幾代血清濃度可降為15%，以后傳代則為10%。

通過本研究方法可以得到大量高純度的豚鼠腦基底動(dòng)脈SMCs，有望為缺血性腦卒中和缺血缺氧性耳聾等疾病的病理生理變化的體外研究及腦血管平滑肌藥物評價(jià)提供一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)材料。