龍 爍 武書庚 崔闖飛 張海軍 王 晶 齊廣海 馬友彪 楊林林

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京100081)

作為一種營養(yǎng)調(diào)控劑，ω-3長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)在調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫功能等方面的作用，逐漸受到重視。其在體內(nèi)參與氧化供能，調(diào)節(jié)脂類介質(zhì)的合成以及細(xì)胞因子的釋放和激活，還參與細(xì)胞膜組成，影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)并影響多種免疫細(xì)胞的功能[1]。營養(yǎng)免疫是在利用特殊營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控機(jī)體免疫情況、增強(qiáng)免疫功能，已受到國內(nèi)外許多學(xué)者重視。免疫營養(yǎng)劑能改變機(jī)體對(duì)病原體的免疫應(yīng)答，當(dāng)以高于適宜量飼喂時(shí)，可改變機(jī)體免疫反應(yīng)，膳食補(bǔ)充ω-3 PUFA的人群炎癥和自身免疫病的發(fā)病率較低，表明ω-3 PUFA具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性[2]。當(dāng)前在家禽中使用的免疫調(diào)節(jié)劑多系人類疾病模型中發(fā)揮抗炎作用的物質(zhì)[3]。

作為一種免疫營養(yǎng)劑，PUFA在臨床上常被用作治療炎性疾病。當(dāng)機(jī)體受到炎癥或免疫的刺激時(shí)，磷脂酶A2(PLA2)會(huì)催化磷脂甘油裂解，產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿(LPC)和類二十烷酸前體[1]。類二十烷酸的代表物質(zhì)有花生四烯酸(AA)、前列腺素(PG)等，急性炎癥反應(yīng)中，PGE2(以AA為前體)不僅發(fā)揮自身的促炎作用，還會(huì)誘發(fā)信號(hào)通路下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)途徑，使促炎細(xì)胞因子——腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)水平升高。ω-3 PUFA作為前體時(shí)，會(huì)產(chǎn)生促炎效果偏弱的PGE3，并以此削弱炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生抗炎效果[1]，同時(shí)也通過抑制樹突細(xì)胞中主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)的表達(dá)，抑制抗原呈遞削弱炎癥反應(yīng)[2]。ω-3 PUFA對(duì)家禽免疫應(yīng)答有潛在調(diào)節(jié)作用[4-5]。魚油是二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的優(yōu)質(zhì)原料，是炎癥反應(yīng)的脂類介質(zhì)的前體物質(zhì)，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[6]，當(dāng)前對(duì)ω-3 PUFA的免疫作用的研究多集中在人體健康的研究中，對(duì)家禽尤其是高峰期產(chǎn)蛋雞的研究較少。因此，本試驗(yàn)在高峰期產(chǎn)蛋雞飼糧中加入不同水平的魚油，探索ω-3 PUFA對(duì)蛋雞免疫器官指數(shù)、體液和細(xì)胞免疫的影響，以期為ω-3 PUFA對(duì)蛋雞免疫機(jī)能的調(diào)節(jié)作用提供試驗(yàn)科學(xué)指導(dǎo)，為臨床營養(yǎng)與免疫關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

試驗(yàn)選用31周齡體況良好、產(chǎn)蛋率接近的海蘭褐蛋雞450只，采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞。對(duì)照組(1組)飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組(2～5組)在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上分別添加0.54%、1.08%、2.17%和4.34%的魚油，DHA含量分別為0.67、1.35、2.70和5.40 mg/g(測(cè)定值為0.76、1.13、2.73和4.55 mg/g)。魚油購自佛山市大茂飼料有限公司，實(shí)測(cè)DHA含量為125 mg/g。各組飼糧(組成及營養(yǎng)水平見表1)等氮等能，參照NY/T 33—2004配制，飼糧脂肪酸組成見表2。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items 組別 Groups12345蛋氨酸 Met0.360.360.360.360.44賴氨酸 Lys0.890.890.890.890.89

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of diets:VA 12 500 IU，VD34 125 IU，VE 15 IU，VK 2 mg，硫胺素 thiamine 1 mg，核黃素 riboflavin 8.5 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 11 mg，煙酸 niacin 32.5 mg，吡哆醇 pyridoxine 8 mg，生物素 biotin 0.5 mg，二氫葉酸 dihydrofolic acid 1.25 mg，VB120.02 mg，Mn 65 mg，I 1 mg，F(xiàn)e 60 mg，Cu 8 mg，Zn 66 mg，膽堿 choline 1 000 mg，植酸酶 phytase 300 mg；蒙脫石 montmorillonite 1 000 mg，酵母培養(yǎng)物 yeast culture 10 g。

2)抗氧化劑為每千克飼糧提供 Antioxidant provided the following per kg of diets:乙氧基喹啉 ethoxyquin 150 mg，VE 100 mg，茶多酚 tea polyphenols 50 mg。

3)代謝能和有效磷為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。The ME and AP were calculated values, while the others were measured values.

表2 飼糧脂肪酸組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞采用3層立體籠養(yǎng)，每籠3只，采用隨機(jī)編號(hào)安排組位，避免環(huán)境和位置影響。試驗(yàn)雞自由采食和飲水，自然光照加人工補(bǔ)光(16 h/d)，光照強(qiáng)度20 lx，舍溫(20±2) ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自然通風(fēng)結(jié)合縱向負(fù)壓通風(fēng)；每天清糞2次，每周消毒1次，常規(guī)免疫。每天喂料3次(08：00、13：00和18：00)，撿蛋1次。試驗(yàn)預(yù)試期1周，正試期12周。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 免疫器官指數(shù)測(cè)定

正試期12周末，每重復(fù)取2只體重相近的蛋雞，稱重，頸靜脈放血致死，取脾臟和胸腺，分別稱重。

胸腺指數(shù)(%)=100×胸腺濕重/體重；脾臟指數(shù)(%)=100×脾臟濕重/體重。

1.3.2 血清免疫球蛋白A(IgA)含量測(cè)定

正試期12周末，每重復(fù)取1只雞，用含促凝劑采血管，空腹無菌翅靜脈采血2～3 mL，37 ℃水浴鍋水浴孵育6～7 h，取上層血清，分裝，-20 ℃儲(chǔ)存。用Abcam公司禽類IgA試劑盒檢測(cè)血清中IgA含量。

1.3.3 血清新城疫、禽流感H9抗體水平測(cè)定

對(duì)照組(1組)和3～5組蛋雞肌肉注射新久安(雞新城疫病毒La Sota株、禽流感病毒H9亞型，SS/94株)二聯(lián)滅活疫苗。分別于注射前和注射后7、14和28 d采血，制備血清(方法見1.3.2)。使用IDVET禽流感H9抗體競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)抗體水平，結(jié)果以S/N%[100×吸光度(OD)樣品值/OD陰性值]表示，S/N%越低，表明H9抗體水平越高。使用IDVET新城疫抗體ELISA試劑盒檢測(cè)新城疫抗體水平。

1.3.4 脾臟細(xì)胞因子基因表達(dá)測(cè)定

正試期12周末，每重復(fù)取1只雞，頸靜脈放血致死，取脾臟10 g左右置于RNA保護(hù)液中，置于液氮。4 ℃溶解RNA保護(hù)液，取80 mg置于含1 mL Trizol的1.5 mL無酶管中，置于樣品研磨儀(上海凈信科技)60 Hz研磨60 s，充分裂解脾臟細(xì)胞；加入200 μL氯仿振蕩30 s，4 ℃孵育3 min，12 000 r/min離心15 min；上清水相轉(zhuǎn)移至新無酶管中，加入等體積異丙醇，4 ℃孵育30 min，10 000 r/min離心10 min；棄上清留沉淀，75%酒精洗滌2次，棄上清留沉淀并晾干，用20～50 μL無酶水溶解沉淀，-80 ℃保存。紫外可見分光光度計(jì)(日本BioSpec-nano公司)測(cè)定總RNA濃度及純度，所有樣品OD比值(OD260 nm/OD280 nm)在1.8～2.0，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性(北京市六一儀器廠，DYY-6C型)。

使用天根FastQuant RT Kit(with gDNase)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA[具體參照FastQuant RT Kit(with gDNase)說明書]，所得cDNA于-20 ℃保存或直接用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)情況：使用天根SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒檢測(cè)白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和干擾素-γ(IFN-γ)基因的表達(dá)量，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)測(cè)定。本研究根據(jù)GenBank上公布的雞IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ基因的保守核苷酸序列，用Primer設(shè)計(jì)并合成5對(duì)特異性引物(引物序列見表3)，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)表達(dá)量為參比，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，其中：△Ct=待測(cè)基因Ct-內(nèi)參基因Ct；△△Ct=試驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct。

1.3.5 脾臟淋巴細(xì)胞增殖和凋亡測(cè)定

脾臟淋巴細(xì)胞的制備：正試期12周末，對(duì)照組、3～5組每重復(fù)取1只雞，無菌剖檢取脾臟，迅速取10 g左右置于200目細(xì)胞過濾網(wǎng)上，同時(shí)加入1～2 mL無菌Hank’s液，用無菌玻璃研磨杵將脾臟組織磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min(4 ℃)，Hank’s液重懸，1 000 r/min離心10 min(4 ℃)，將細(xì)胞懸浮于2 mL RPMI1640培養(yǎng)基，并稀釋到2×107個(gè)/mL。

表3 引物序列

增殖檢測(cè)：淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：終濃度為2×107個(gè)/mL的脾淋巴細(xì)胞，使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔10 μL加2孔，第一孔加入90 μL含有刀豆球蛋白(ConA，SIGMA公司)的RPMI1640培養(yǎng)基(ConA濃度為20 μg/mL)，第二孔加入90 μL RPMI1640培養(yǎng)基。設(shè)置4個(gè)空白對(duì)照孔(只加RPMI1640培養(yǎng)基)，于5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)72 h。使用Abcam Brdu Cell Proliferation ELISA Kit試劑盒進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖情況測(cè)定。第48～72 h內(nèi)，每孔加入稀釋后的BruU標(biāo)記液10 μL，培養(yǎng)12～24 h。按照BrdU ELISA檢測(cè)試劑盒中步驟完成對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖程度測(cè)定，在450/540 nm雙波長下測(cè)定每孔OD值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析(one-way ANOVA)程序，進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較和指標(biāo)的相關(guān)分析；顯著水平為P<0.05，趨勢(shì)水平為P<0.10。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)生產(chǎn)性能結(jié)果表明(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，不同水平魚油對(duì)試驗(yàn)全期蛋雞產(chǎn)蛋率、平均蛋重、產(chǎn)蛋量和平均日采食量無顯著影響(P>0.05)，其中4.34%魚油組(5組)料蛋比顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.1 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞免疫器官指數(shù)和體液免疫的影響

由表4可知，飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)無顯著影響(P>0.05)，對(duì)蛋雞血清IgA含量也無顯著影響(P>0.05)，其中4.34%魚油組血清IgA含量最高。免疫后不同時(shí)間點(diǎn)血清禽流感H9抗體水平檢測(cè)結(jié)果(圖1)表明，免疫后7和14 d，試驗(yàn)組血清禽流感H9抗體S/N%值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，表示試驗(yàn)組血清禽流感H9抗體水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中2.17%魚油組抗體水平最高，但不同試驗(yàn)組間無顯著差異(P>0.05)；免疫后28 d，試驗(yàn)組血清禽流感H9抗體S/N%值有低于對(duì)照組的趨勢(shì)(P<0.10)，表示試驗(yàn)組血清禽流感H9抗體水平有高于對(duì)照組的趨勢(shì)，其中4.34%魚油組抗體水平最高。隨著免疫后時(shí)間延長，各組血清禽流感H9抗體S/N%值均降低，表明血清禽流感H9抗體水平逐漸升高。免疫后不同時(shí)間點(diǎn)血清新城疫抗體水平檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明，免疫后7 d，試驗(yàn)組血清新城疫抗體水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中1.08%魚油組血清新城疫抗體水平最高；免疫后14 d，試驗(yàn)組血清新城疫抗體水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但各試驗(yàn)組間無顯著差異(P>0.05)；免疫后28 d，試驗(yàn)組血清新城疫抗體水平與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，其中1.08%魚油組血清新城疫抗體水平最高。同時(shí)，隨著免疫后時(shí)間延長，各組血清新城疫抗體水平均升高。

表4 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞免疫器官指數(shù)和體液免疫的影響

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。圖2同。

* mean significantly different compared with the control group (P<0.05). The same as Fig.2.

圖1飼糧添加魚油對(duì)蛋雞免疫后不同時(shí)間點(diǎn)血清禽流感H9抗體水平的影響

Fig.1 Effects of dietary fish oil on serum avian influenza virus H9 subtype antibody levels of laying hens at different time points after immunization

圖2 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞

2.2 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。由圖可知，0.54%、1.08%、2.17%魚油組蛋雞脾臟IL-2和IL-6基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)，4.34%魚油組蛋雞脾臟IL-2和IL-6基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，1.08%和2.17%魚油組蛋雞脾臟IL-10基因相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，0.54%和4.34%魚油組無顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，0.54%和2.17%魚油組蛋雞脾臟IFN-γ基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，1.08%魚油組蛋雞脾臟IFN-γ基因相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，4.34%魚油組蛋雞脾臟IFN-γ基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P>0.05)。

2.3 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和凋亡率的影響

飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和凋亡率的影響結(jié)果見圖4。由圖可知，與對(duì)照組相比，1.08%和2.17%魚油組蛋雞脾臟淋巴細(xì)胞在ConA刺激下轉(zhuǎn)化率(刺激指數(shù))無顯著差異(P>0.05)，4.34%魚油組顯著降低(P<0.05)。各組間蛋雞脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞免疫器官指數(shù)和體液免疫的影響

本試驗(yàn)中，飼糧添加不同水平魚油對(duì)蛋雞免疫器官指數(shù)無顯著影響，但有研究發(fā)現(xiàn)肉雞飼糧補(bǔ)充3%的魚油(DHA占總脂肪酸的21.9%)對(duì)胸腺重量有顯著影響、對(duì)脾臟重量無顯著影響[7]，這與本試驗(yàn)結(jié)果不完全一致，可能是由于魚油中脂肪酸組成有差異或家禽品種、日齡不一致。IgA是外分泌液中主要的免疫球蛋白，分為血清型IgA和分泌型IgA(sIgA)2種，血清型IgA主要由腸系膜淋巴組織的漿細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗菌、抗病毒作用。膳食魚油在許多動(dòng)物疾病模型中有顯著的臨床、免疫和生物化學(xué)作用，包括顯著增加人體器官移植存活率并降低患有自身免疫性腎小球腎炎(IgA腎病)的小鼠的蛋白尿，這可能是通過魚油中ω-3 PUFA競爭性抑制環(huán)加氧酶及脂加氧酶對(duì)AA的作用，使中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的白三烯B4(LTB4)減少，取而代之產(chǎn)生非炎癥的PGE3和白三烯B5(LTB5)[8]，從而減少IgA在腎小球系膜處沉積。在機(jī)體處于炎性狀態(tài)時(shí)，魚油中ω-3 PUFA會(huì)減少IgA的產(chǎn)生，緩解炎性疾病。當(dāng)前對(duì)健康機(jī)體外周血IgA水平的影響的研究也較少。本試驗(yàn)研究表明，飼糧添加不同水平魚油對(duì)蛋雞血清IgA含量無顯著影響，可能是因?yàn)榈半u處于健康生理狀態(tài)，體內(nèi)類二十烷酸分泌未出現(xiàn)異常。關(guān)于魚油對(duì)健康禽類血清型IgA水平的影響的相關(guān)研究目前較少，還需進(jìn)一步研究。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖4同。

* mean significantly different (P<0.05), ** mean extremely significantly different (P<0.01). The same as Fig.4.

圖3飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

Fig.3 Effects of dietary fish oil on cytokine gene expression in spleen of laying hens

體液免疫包括外周血免疫球蛋白含量和抗體介導(dǎo)的特異與非特異性免疫。禽流感是一種由A型流感病毒引起的禽類感染疾病綜合征，嚴(yán)重影響禽類養(yǎng)殖。本試驗(yàn)結(jié)果中，免疫后7和14 d試驗(yàn)組禽流感H9抗體水平顯著高于對(duì)照組且28 d后仍有高于對(duì)照組的趨勢(shì)。采用血凝抑制反應(yīng)法測(cè)定新城疫抗體水平發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加3%的魚油，血清新城疫抗體水平顯著高于對(duì)照組[7]。He等[9]在家禽飼糧中補(bǔ)充4.5%的魚油，1次免疫后14 d和2次免疫后9 d，正常組和注射環(huán)磷酰胺組的新城疫抗體水平顯著高于玉米油組，說明肉仔雞正常生理狀態(tài)或免疫抑制狀態(tài)下，含ω-3 PUFA的魚油均能提高體液免疫水平，發(fā)揮免疫調(diào)控作用，這與Guo等[10]的研究結(jié)果一致。也有報(bào)道家禽中補(bǔ)充魚油對(duì)體液免疫沒有改善作用[11]。不同的試驗(yàn)結(jié)果可能是由于不同的飲食基礎(chǔ)、脂肪酸水平或抗原類別不同。

圖4 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和凋亡率的影響

本試驗(yàn)免疫二聯(lián)苗后蛋雞無不良反應(yīng)，飼糧補(bǔ)充ω-3 PUFA可改善動(dòng)物體液免疫水平，提高抗體效價(jià)。

3.2 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

細(xì)胞因子是在炎癥和免疫應(yīng)答過程中由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的小分子多肽或蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子的產(chǎn)生受類二十烷酸的調(diào)節(jié)[5]，飲食脂肪酸會(huì)影響類二十烷酸的產(chǎn)生，所以膳食脂質(zhì)尤其是ω-3 PUFA會(huì)影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生。研究表明DHA可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖及自然殺傷細(xì)胞的活化，進(jìn)而影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生[1]。T細(xì)胞可發(fā)展為功能不同的Th1和Th2亞群，IL-2和TNF主要由Th1型細(xì)胞分泌，而白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)和IL-10由Th2型細(xì)胞分泌[12]。細(xì)胞因子中IL-2、IL-6和TNF都是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)[13]。Friedman等[14]研究表明，過高或過低ω-3 PUFA會(huì)抑制體內(nèi)或體外IL-2的分泌。與對(duì)照組(低ω-3 PUFA)相比，膳食補(bǔ)充ω-3 PUFA可降低人外周血單核細(xì)胞中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α水平[2]。

有些體外試驗(yàn)表明，高水平ω-3 PUFA會(huì)降低動(dòng)物細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)和IL-2基因表達(dá)量[15]。本試驗(yàn)表明，IL-2基因相對(duì)表達(dá)量隨魚油添加水平升高而下降，可能是由于飼糧中ω-3 PUFA含量的增加，導(dǎo)致LTB4減少，來源于ω-6 PUFA的LTB4能增加血管的滲透性和血液的流動(dòng)性，調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)TNF-α、IL-2、IL-6和IL-1的產(chǎn)生[13]。同時(shí)，因?yàn)?、4型Toll樣受體(TLR)及活化分子表達(dá)減弱，介導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白表達(dá)下降，導(dǎo)致膳食魚油降低人的IL-2和TNF-α表達(dá)[16]。Mayer等[17]研究表明魚油類ω-3 PUFA能明顯抑制單核細(xì)胞在受到內(nèi)毒素刺激時(shí)對(duì)IL-6和IL-8的釋放，盡管表面黏附因子表達(dá)無顯著改變，但其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果表明IL-6相對(duì)表達(dá)量也隨著飼糧魚油添加水平升高而降低。ω-3 PUFA抑制NF-κB的激活也是抑制炎性因子產(chǎn)生及降低炎性細(xì)胞反應(yīng)調(diào)節(jié)免疫的重要機(jī)制[18]。研究表明人體每天補(bǔ)充1.1～5.0 g的EPA+DHA數(shù)周，可減少外周血單核細(xì)胞的增殖，且IL-2、IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)量降低[19]。

IL-10是抗炎類細(xì)胞因子，創(chuàng)傷后炎性因子釋放機(jī)體立即產(chǎn)生IL-10、白細(xì)胞介素-13(IL-13)等抗炎因子對(duì)抗原發(fā)促炎反應(yīng)[19]。食用適當(dāng)比例DHA和EPA后2個(gè)月后，適當(dāng)ω-3 PUFA可以活化人體白細(xì)胞同時(shí)促進(jìn)IFN-γ的分泌[20]。給小鼠飼喂富含魚油的飼糧提高了體內(nèi)IFN-γ含量[21]。Sijben等[22]報(bào)道，在飲食中添加魚油(作為ω-3脂肪酸的來源)可以增加細(xì)胞因子如IFN-γ的產(chǎn)生。飼糧中補(bǔ)充3%的魚油(DHA占總脂肪酸的21.9%)，能顯著提高脾臟中IFN-γ基因的相對(duì)表達(dá)量，可能歸因于補(bǔ)充魚油提高了先天免疫細(xì)胞活性如Th2細(xì)胞并降低類二十烷酸的產(chǎn)生[7]。另外，也有體外試驗(yàn)表明魚油通過降低PGE2的產(chǎn)生進(jìn)而促進(jìn)IFN-γ的分泌[22]。創(chuàng)傷患者在補(bǔ)充魚油后3和6 d外周血IFN-γ水平顯著上升。表明補(bǔ)充ω-3 PUFA可顯著降低創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)程度，促進(jìn)細(xì)胞免疫功能恢復(fù)，避免過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19]。

高劑量的魚油組降低細(xì)胞因子的基因表達(dá)，可能是由于免疫細(xì)胞膜磷脂中不飽和脂肪酸含量增加，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，造成膜損傷影響免疫細(xì)胞功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在正常生理狀態(tài)下，沒有病毒或其他誘生劑的作用，各種細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果符合正常機(jī)體免疫應(yīng)答狀態(tài)，飼糧補(bǔ)充魚油對(duì)機(jī)體是有利的，能增強(qiáng)先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答能力，同時(shí)也取決于免疫應(yīng)答的狀態(tài)。

3.3 飼糧添加魚油對(duì)蛋雞脾臟淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和凋亡率的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，除4.34%魚油組外，其他各組飼糧補(bǔ)充魚油對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖和凋亡沒有顯著影響。Pompos等[23]研究表明ConA刺激下淋巴細(xì)胞體外增殖不受ω-3 PUFA添加影響。Calder等[24]研究表明富含ω-3 PUFA的魚油能降低小鼠對(duì)ConA刺激下淋巴細(xì)胞的分裂，同時(shí)觀察到降低了小鼠淋巴細(xì)胞發(fā)育所必需的白細(xì)胞介素和TNF產(chǎn)量。飼糧添加7%的魚油抑制淋巴細(xì)胞增殖[11]，因?yàn)門細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2可誘導(dǎo)T細(xì)胞的分化，過量ω-3 PUFA導(dǎo)致IL-2表達(dá)量降低，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞的增殖[25]。有研究發(fā)現(xiàn)低濃度(50 nmol/L)的AA、DHA、EPA在體外對(duì)臍血源單核細(xì)胞凋亡無影響，中濃度(100 nmol/L)情況下DHA會(huì)顯著增加單核細(xì)胞凋亡率[26]。之前有研究表明，當(dāng)補(bǔ)充EPA+DHA在2.4～9.6 g/d時(shí)，會(huì)降低嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的活性，通過減少單核細(xì)胞數(shù)量減少IL-6、IL-2和IFN-γ的表達(dá)[27]，同時(shí)也會(huì)減少淋巴細(xì)胞的增殖[28]。Kew等[29]在150名健康志愿者中分別提供0.77或1.7 g/d EPA+DHA持續(xù)6個(gè)月，發(fā)現(xiàn)攝入不同水平的EPA+DHA并未改變ConA刺激下外周血淋巴細(xì)胞的增殖情況，說明適當(dāng)攝入ω-3 PUFA不會(huì)對(duì)免疫細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加魚油未見影響蛋雞免疫器官指數(shù)和血清IgA水平。

② 免疫后7和14 d，魚油組禽流感H9和新城疫抗體水平顯著高于對(duì)照組，28 d各組間無顯著差異。

③ 飼糧添加4.34%魚油顯著降低脾臟IL-2和IL-6基因的相對(duì)表達(dá)量，添加1.08%和2.17%魚油顯著提高脾臟IL-10和IFN-γ基因的相對(duì)表達(dá)量。

④ 飼糧添加4.34%魚油顯著降低脾臟淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，其余試驗(yàn)組未見顯著影響脾臟淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和凋亡率。