魏洪城 郁歡歡 陳曉明 晁 偉 鄒方起 陳 沛 鄭銀樺 吳秀峰 梁旭方 薛 敏，4*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京100081；2.北京首朗生物科技有限公司，北京100041；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070；4.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，草魚(yú)(Ctenopharyngodonidllus)產(chǎn)量居水產(chǎn)養(yǎng)殖之首，年產(chǎn)量超過(guò)500萬(wàn)t[1]。草魚(yú)屬于植物食性魚(yú)類(lèi)，配合飼料中魚(yú)粉等動(dòng)物性蛋白質(zhì)的使用量很低，飼料中以豆粕、棉籽粕及菜籽粕等植物性蛋白質(zhì)原料為主。相對(duì)于棉籽粕和菜籽粕而言，豆粕因其產(chǎn)量高、適口性好和消化率高，草魚(yú)腸道肝胰臟對(duì)豆粕的酶解消化能力優(yōu)于其他植物性蛋白質(zhì)，應(yīng)用最為廣泛[2-3]。但已有許多研究表明，對(duì)于魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)，植物性蛋白質(zhì)存在必需氨基酸不平衡[4]、含有抗?fàn)I養(yǎng)因子(如脲酶、胰蛋白酶等)[5-6]、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題[7-9]，并且豆粕中含蛋白酶抑制劑和大豆凝集素，會(huì)抑制魚(yú)類(lèi)的消化酶活性[10-11]，導(dǎo)致其過(guò)量使用后不利于水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和健康。雖然可以通過(guò)發(fā)酵、物理加工、多蛋白質(zhì)源配伍、補(bǔ)充外源氨基酸等方法在一定程度彌補(bǔ)植物性蛋白質(zhì)的一些缺陷，但是有報(bào)道表明，對(duì)于植物食性魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)，過(guò)量使用豆粕引發(fā)的腸道和肝胰臟病變等問(wèn)題依然很難得到有效解決[12-13]，因此，尋找抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較低的非動(dòng)物源性飼料蛋白質(zhì)源，如單細(xì)胞蛋白質(zhì)，對(duì)植物食性魚(yú)類(lèi)消化系統(tǒng)的健康十分重要。

隨著微生物發(fā)酵技術(shù)逐步應(yīng)用到飼料工業(yè)生產(chǎn)中，一些國(guó)家已經(jīng)建立了菌體蛋白產(chǎn)業(yè)(MBP)，菌體蛋白蛋白質(zhì)含量高，且氨基酸組成相對(duì)齊全，富含維生素和多種微量元素[14]，還能使飼料具有一定鮮味從而改善其適口性[15]；同時(shí)，其具有生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)原料來(lái)源廣、可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，目前已有相當(dāng)部分菌體蛋白在畜禽和水產(chǎn)飼料中應(yīng)用[16]。但菌體蛋白產(chǎn)品質(zhì)量很大程度受非蛋白氮含量的影響，部分產(chǎn)品使用質(zhì)量較差，例如味精菌體蛋白存在真蛋白質(zhì)含量低、氨基酸不平衡和氨基酸消化率低等問(wèn)題[17]。

乙醇梭菌蛋白是以乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)為發(fā)酵菌種生產(chǎn)的一種新型菌體蛋白。乙醇梭菌最早由Abrini等[18]從兔子糞便中分離得到，在生產(chǎn)工藝中以一氧化碳(CO)為原料，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)離心、干燥后獲得高蛋白質(zhì)生物飼料原料乙醇梭菌蛋白。乙醇梭菌蛋白目前在水產(chǎn)飼料中還沒(méi)有明確的評(píng)估數(shù)據(jù)，為此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了乙醇梭菌蛋白替代豆粕的梯度添加試驗(yàn)，研究其對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能、血漿生化指標(biāo)及肝胰臟和腸道組織病理的影響，為乙醇梭菌蛋白在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用乙醇梭菌蛋白為淡黃色粉末，由北京首朗生物科技有限公司提供，粗蛋白質(zhì)含量為84.69%，胃蛋白酶消化率為90.2%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)飼料

選擇初始體重為(25.70±0.03) g的草魚(yú)540尾，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)。對(duì)照組(J0組)飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組分別用5%(J5組)和10%(J10組)的乙醇梭菌蛋白替代基礎(chǔ)飼料中27.5%和55.0%的豆粕。

豆粕中缺乏蛋氨酸，富含精氨酸，而乙醇梭菌蛋白與之相反，因此隨著乙醇梭菌蛋白添加量增加，飼料中DL-蛋氨酸(DL-Met)的添加量逐步減少，而L-精氨酸(L-Arg)的添加量逐步增加。各飼料原料按照添加量從小到大的順序逐級(jí)攪拌混勻，采用雙螺桿干法膨化機(jī)制成粒徑2 mm的擠壓膨化浮性顆粒飼料(TSE65型，北京現(xiàn)代洋工機(jī)械科技發(fā)展有限公司)。3組飼料等氮等能且必需氨基酸均滿(mǎn)足草魚(yú)需求[19]。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)飼料氨基酸組成見(jiàn)表2。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目Items組別 Groups J0J5J10磷脂油 Phospholipid oil1.001.001.00合計(jì) Total100.00100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels粗蛋白質(zhì) Crude protein31.5731.7131.31粗脂肪 Crude lipid6.257.916.10水分 Moisture12.3211.3712.19粗灰分 Crude ash7.307.267.07總能 Gross energy/(MJ/kg)18.1918.6818.09

1)乙醇梭菌蛋白營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels ofClostridiumautoethanogenumprotein：粗脂肪 crude lipid 0.16%，水分 moisture 6.90%，粗蛋白質(zhì) crude protein 84.69%，粗灰分 ash 6.80%，總能 gross energy 22.04 MJ/kg，賴(lài)氨酸 Lys 8.70%，蛋氨酸 Met 2.29%，蘇氨酸 Thr 4.02%,?；撬?Tau 0.02%，磷 P 0.92%，精氨酸 Arg 3.40%。

2)依據(jù)魚(yú)類(lèi)理想蛋白質(zhì)模式[20]，草魚(yú)飼料中蛋氨酸和精氨酸水平約占飼料粗蛋白質(zhì)水平的2%和5%進(jìn)行氨基酸平衡。According to the ideal protein pattern of fish[20], made the amino acid balance based on dietary methionine and arginine levels ofCtenopharyngodonidllusaccount for about 2% and 5% dietary crude protein level.

3)預(yù)混料為每千克飼料提供 Premix provided the following per kg of diets: VA 20 mg,VB110 mg,VB215 mg,VB615 mg,VB128 mg,VE 400 mg,VK320 mg,VD310 mg,煙酸胺 niacinaminde 100 mg,維生素C磷酸酯L-ascorbate-2-monophosphate 1 000 mg,肌醇200 mg,泛酸鈣 calcium pantothenate 40 mg, 生物素 biotin 2 mg,葉酸 folic acid 10 mg,氯化膽堿 choline chloride 3 000 mg,玉米蛋白粉 corn protein powder 150 mg,CuSO4·5H2O 10 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 300 mg, ZnSO4·H2O 220 mg,MnSO4·H2O 25 mg,KIO33 mg,Na2SeO35 mg,CoCl2·6H2O 5 mg,MgSO42 000 mg，沸石粉 zeolite 332 mg。

表2 試驗(yàn)飼料氨基酸組成

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)正式開(kāi)始前，試驗(yàn)魚(yú)在養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間投喂對(duì)照組飼料。試驗(yàn)在北京南口國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地室內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，水源為曝氣井水，流量為9.64 L/min。用2%食鹽水消毒試驗(yàn)魚(yú)及養(yǎng)殖系統(tǒng)后，隨機(jī)挑選體質(zhì)健康、個(gè)體均勻的草魚(yú)，分配到容積為0.26 m3的圓錐形養(yǎng)殖桶中。養(yǎng)殖試驗(yàn)從2016年9月26日到2016年12月4日，共10周。

試驗(yàn)期間每天表觀(guān)飽食投喂4次，投喂時(shí)間分別為08：00、11:00、15:00、19:00。定期檢測(cè)水質(zhì)，條件保持在溶氧濃度>7.0 mg/L；總氨氮濃度<0.3 mg/L；pH 7.5～8.5；水溫(22±1) ℃，自然光照。

1.4 樣品采集及檢測(cè)分析

1.4.1 樣品采集

試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，取12尾魚(yú)作為初始全魚(yú)樣品，每4尾作為1個(gè)混合樣品。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每桶魚(yú)饑餓24 h后稱(chēng)重，每桶取3尾魚(yú)做終末全魚(yú)樣品，每桶再隨機(jī)取3～4尾魚(yú)，用80 mg/L三氯叔丁醇(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)麻醉后，分別測(cè)量其體長(zhǎng)(自吻端至椎骨末端的長(zhǎng)度)、體重，之后尾部取血，加入30 μL/mL抗凝劑(2%NaF+4%草酸鉀)，在4 ℃、4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清血漿保存于-80 ℃的冰箱中待測(cè)。每桶隨機(jī)取2尾魚(yú)的肝胰臟(膽管連接部位)和后腸(距離肛門(mén)10 mm)經(jīng)4%多聚甲醛液中固定24～48 h，經(jīng)脫水，包埋，連續(xù)切片6 μm，后經(jīng)脫蠟并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微觀(guān)察。

1.4.2 檢測(cè)分析

分別采用105 ℃常壓干燥法(GB/T 6435—2006)、凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)、酸水解粗脂肪測(cè)定法(GB/T 6433—2006)、550 ℃灼燒法(GB/T 6438—2007)、過(guò)濾法(GB/T 17811—2008)測(cè)定原料、飼料和魚(yú)體的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量及胃蛋白酶消化率；總能的檢測(cè)方法參照ISO-9831:1998[21]采用氧彈儀測(cè)定；飼料中氨基酸含量采用國(guó)標(biāo)(GB/T 18246—2000)方法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品至少測(cè)定2個(gè)重復(fù)。

血漿生化指標(biāo)包括：總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(Glu)、免疫球蛋白M(IgM)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、丙二醛(MDA)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，試驗(yàn)所用TC和TG試劑盒購(gòu)自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司，其余試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，檢測(cè)使用酶標(biāo)儀(Bio-Tek，Burlington，美國(guó))法。

生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

存活率(survival rate,SR,%)=100×Nt/N0；增重率(weight gain rate, WGR, %)=100×(Wt-W0+Wd)/W0；特定生長(zhǎng)率(specific growth rate, SGR, %/d)=100×(lnFBW-lnIBW)/t；飼料系數(shù)(feed conversion ratio, FCR)=C/(Wt+Wd-W0)；攝食率(feeding rate, FR, %)=100×C/[(W0+Wt+Wd)/2]/t；蛋白質(zhì)沉積率(produced protein value, PPV, %)=100×(Wt×Bpt-W0×Bp0)/(C×Dp)；肥滿(mǎn)度(condition factor, CF, %)=100×平均體重(g)/[平均體長(zhǎng)(cm)]3；臟體比(viscera-somatic index, VSI, %)=100×內(nèi)臟重(g)/全魚(yú)重(g)；肝胰指數(shù)(hepato-somatic index, HSI, %)=100×肝胰臟重(g)/全魚(yú)重(g)；脾臟指數(shù)(spleen-somatic index, SSI, %)=100×脾臟重(g)/全魚(yú)重(g)。

式中：Nt為終末魚(yú)數(shù)(尾)；N0為初始魚(yú)數(shù)(尾)；IBW為魚(yú)體初始均重(g)；FBW為終末均重(g)；W0為魚(yú)體初始總重(g)；Wt為魚(yú)體終末總重(g)；Wd為死亡魚(yú)體總重(g)；C為攝食量(g)；Bpt為終末魚(yú)體蛋白質(zhì)含量(%)；Bp0為初始魚(yú)體蛋白質(zhì)含量(%)；Dp為飼料蛋白質(zhì)含量(%)；t為養(yǎng)殖天數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏多重比較法檢驗(yàn)差異顯著性，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)的影響

乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)的影響見(jiàn)表3。J5組末均重、增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；J10組末均重、增重率和特定生長(zhǎng)率低于J5組，高于對(duì)照組，但均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。J5和J10組飼料系

數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，J5組最低。各組攝食率雖然沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但隨著乙醇梭菌蛋白添加量的增加有提高趨勢(shì)。各組蛋白質(zhì)沉積率沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。J10組存活率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。J5組肝胰指數(shù)顯著低于J10組(P<0.05)，但二者均與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。各組臟體比、肥滿(mǎn)度和脾臟指數(shù)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

表3 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能和形體指標(biāo)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。表4和表5同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4 and Table 5.

2.2 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)血漿生化指標(biāo)的影響

乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)血漿生化指標(biāo)的影響見(jiàn)表4。J5和J10組血漿TC含量顯著低于J0組(P<0.05)；J10組血漿Glu含量顯著高于J0組(P<0.05)；J10組血漿AST活性顯著高于J5組(P<0.05)，J5組顯著高于J0組(P<0.05)；J10組血漿ALT活性顯著低于J0和J5組(P<0.05)。雖然各組血漿AST和ALT活性均低于文獻(xiàn)報(bào)道的正常范圍值，但J10組血漿AST/ALT劇烈升高，顯著高于J0和J5組(P<0.05)。

各組血漿特異性免疫指標(biāo)IgM、IL-8和IL-1α含量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。J5組血漿MDA含量顯著低于J0和J10組(P<0.05)。各組血漿T-SOD活性沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

2.3 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)體成分的影響

乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)體成分的影響見(jiàn)表5。J10組的全魚(yú)水分含量顯著高于J5組(P<0.05)，但各組的全魚(yú)粗灰分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

2.4 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)肝胰臟和腸道組織病理的影響

各組草魚(yú)肝胰臟組織切片結(jié)果見(jiàn)圖1，肝胰臟組織病理診斷分析結(jié)果見(jiàn)表6。各組草魚(yú)肝胰臟均出現(xiàn)一定比例的輕微病理現(xiàn)象，其中J0組肝胰臟11個(gè)樣本中，9尾正常(圖1-A)，1尾出現(xiàn)細(xì)胞空泡，疑似脂肪肝現(xiàn)象(圖1-B)，1尾出現(xiàn)細(xì)胞核增加聚集、肝細(xì)胞結(jié)節(jié)現(xiàn)象(圖1-C)；J5組11個(gè)樣本中,8尾正常，1尾出現(xiàn)細(xì)胞空泡，2尾出現(xiàn)細(xì)胞核增加聚集、肝細(xì)胞結(jié)節(jié)現(xiàn)象；J10組11個(gè)樣本中，7尾正常，1尾輕出現(xiàn)微脂肪肝，3尾出現(xiàn)肝細(xì)胞結(jié)節(jié)現(xiàn)象。以上結(jié)果說(shuō)明，乙醇梭菌蛋白添加量增加有逐步加劇肝細(xì)胞核聚集、細(xì)胞致密化的趨勢(shì)，結(jié)合J10組血漿中陡增的AST/ALT，推測(cè)該組肝組織損傷程度較J0、J5組較高。

表4 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)血漿生化指標(biāo)的影響

表5 乙醇梭菌蛋白替代豆粕對(duì)草魚(yú)體成分的影響

A：正常細(xì)胞；B：細(xì)胞空泡化，脂肪肝癥狀(黑色箭頭)；C：細(xì)胞結(jié)節(jié)化，核聚集(黑色箭頭)。

A: normal cells; B: vacuoles cells, fatty liver symptom (black arrow); C: nodular cells, nucleus aggregation (black arrow).

圖1 肝胰臟組織切片

各組草魚(yú)后腸組織切片結(jié)果見(jiàn)圖2，后腸組織病理診斷分析結(jié)果見(jiàn)表7。各組均出現(xiàn)不同程度地后腸組織損傷，其中J0組后腸11個(gè)樣本中，6尾正常(圖2-A)，4尾出現(xiàn)微絨毛脫落、固有層疏松、杯狀細(xì)胞減少或消失癥狀(圖2-B)；J5、J10組腸道結(jié)構(gòu)均稍有改善，11個(gè)樣品中均有8尾正常，J5組2尾出現(xiàn)微絨毛脫落、固有層疏松、杯狀細(xì)胞減少或消失癥狀癥狀，1尾出現(xiàn)絨毛高度變淺、肌層變薄現(xiàn)象(圖2-C)；J10組3尾出現(xiàn)微絨毛脫落、固有層疏松、杯狀細(xì)胞減少或消失癥狀癥狀。

表7 后腸組織病理診斷分析

3 討 論

乙醇梭菌蛋白由乙醇梭菌經(jīng)生物發(fā)酵而得，乙醇梭桿菌細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，嚴(yán)格厭氧生長(zhǎng)，兼性化能自養(yǎng)，與環(huán)境隔離，性狀穩(wěn)定，對(duì)氯霉素、青霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素敏感[18]，目前已經(jīng)獲得了比較完整的基因組序列，無(wú)有毒基因的報(bào)道[26-27]。乙醇梭菌利用CO和二氧化碳(CO2)作為碳源生長(zhǎng)，發(fā)酵CO或者CO2和氫氣(H2)生成乙醇或乙酸鹽，在生產(chǎn)工藝中以鋼鐵工業(yè)煤氣(轉(zhuǎn)爐煤氣、高爐煤氣)中的CO為碳源，以氨水為氮源，培養(yǎng)基由磷酸(H3PO4)、氫氧化鉀(KOH)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸亞鐵(FeSO4)及少量維生素(維生素B1、維生素B2、維生素B5、維生素B6、維生素B12、煙酸、葉酸及生物素)組成，經(jīng)氣體預(yù)處理、發(fā)酵、蒸餾脫水、菌體分離、噴霧干燥及污水處理5個(gè)流程，最后得到乙醇等清潔能源及菌體蛋白，每生產(chǎn)1萬(wàn)t乙醇，大約可以獲得1 500 t菌體蛋白，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛能。乙醇梭菌蛋白作為鋼鐵工業(yè)煤氣發(fā)酵制燃料乙醇的附屬產(chǎn)品，極大促進(jìn)工業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化再利用，減少了有害氣體的排放，與傳統(tǒng)植物源性蛋白質(zhì)相比，不含抗?fàn)I養(yǎng)因子，而相對(duì)于動(dòng)物源性蛋白質(zhì)，具有較低的沙門(mén)氏菌、生物胺等，乙醇梭菌蛋白的生產(chǎn)具有綠色、節(jié)能、環(huán)保的特性。但是由于乙醇梭菌蛋白屬于微生物發(fā)酵產(chǎn)品，且乙醇梭桿菌尚未進(jìn)入我國(guó)飼料添加劑目錄，因此針對(duì)乙醇梭桿菌菌種的生物安全性的全面評(píng)估需要進(jìn)一步深入研究。

乙醇梭菌蛋白的粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)80%以上，且易于動(dòng)物消化吸收，富含多種微量元素，不含抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)富含18種氨基酸，總氨基酸占蛋白質(zhì)的含量≥85%，其中賴(lài)氨酸和含硫氨酸含量相對(duì)較高，但精氨酸相對(duì)缺乏。蛋白質(zhì)是魚(yú)類(lèi)最主要的營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源，魚(yú)類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)的需求實(shí)際是對(duì)必需氨基酸的需求，蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)平衡實(shí)際上是氨基酸平衡，必須氨基酸的缺乏，往往會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)的一些營(yíng)養(yǎng)性疾病和癥狀的產(chǎn)生[28]。

A：正常腸道組織結(jié)構(gòu)；B：微絨毛(V)脫落，固有層(LP)疏松，杯狀細(xì)胞(GC)消失；C：絨毛高度變淺，肌層(Ms)變薄。

A: normal intestinal tissue structure; B: microvillus (V) drop, lamina propria (LP) failure, and goblet cell (GC) lose; C: villus height short, muscularis (Ms) thinning.

圖2后腸組織切片

Fig.2 Histological sections of posterior intestine

蛋氨酸在機(jī)體代謝中有著十分重要的作用，是魚(yú)類(lèi)所必需而植物性蛋白質(zhì)含量不足的限制性氨基酸，特別是豆類(lèi)原料的第一限制性氨基酸。有研究表明，飼料中蛋氨酸缺乏會(huì)顯著降低動(dòng)物血漿胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)含量[29]，動(dòng)物的攝食受到IGF-1的調(diào)節(jié)[30]，因此，蛋氨酸的促生長(zhǎng)作用可能與提高了生長(zhǎng)中期草魚(yú)血漿IGF-1含量有關(guān)，具體機(jī)制還有待深入研究。王勝[31]和唐炳榮等[32]報(bào)道，提高飼料中蛋氨酸水平能提高草魚(yú)幼魚(yú)和生長(zhǎng)中期草魚(yú)的增重、攝食量、飼料效率、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率；廖英杰[33]在團(tuán)頭魴幼魚(yú)對(duì)蛋氨酸需要量的研究中也得到了相同的結(jié)論，同時(shí)王勝[31]還發(fā)現(xiàn)增重率、特殊生長(zhǎng)率、飼料效率、蛋白質(zhì)效率等還受飼料精氨酸水平影響。豆粕為飼料主要蛋白質(zhì)源，相對(duì)于魚(yú)類(lèi)飼料理想蛋白模式以蛋氨酸/粗蛋白質(zhì)約2%、精氨酸/粗蛋白質(zhì)約5%來(lái)計(jì)，豆粕中缺乏蛋氨酸，而乙醇梭菌蛋白中的缺乏精氨酸，因此本試驗(yàn)補(bǔ)充了相應(yīng)的限制性氨基酸，但草魚(yú)屬于無(wú)胃魚(yú)，可能對(duì)晶體氨基酸的利用能力不足，無(wú)法同步吸收外源晶體氨基酸，鄭宗林等[34]和譚芳芳[35]都曾有草魚(yú)對(duì)晶體氨基酸利用效率相對(duì)不高的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)中，隨著乙醇梭菌蛋白添加量的增加，豆粕添加量的減少，J5組飼料中的內(nèi)源性結(jié)合態(tài)蛋氨酸高于J0組，這可能是J5組增重率、末均重、特定生長(zhǎng)率和飼料效率高于J0組的原因，但J10組生長(zhǎng)性能和J0組差異不顯著，這可能是由于J10組內(nèi)源性精氨酸缺乏引起氨基酸不平衡所致。

氨基酸也是保證腸道組織緊密連接和結(jié)構(gòu)完整的重要營(yíng)養(yǎng)素[36]，特別是蛋氨酸和精氨酸對(duì)維持腸道健康具有重要作用。精氨酸在精氨酸酶(arginase)的作用下生成鳥(niǎo)氨酸，鳥(niǎo)氨酸經(jīng)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的作用生成多胺(精胺、腐胺、精胺)，多胺不僅對(duì)腸道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和成熟起著重要作用，還對(duì)腸黏膜發(fā)育和腸道形態(tài)修復(fù)具有不可替代的作用[37]，Cheng等[38-39]在雜交條紋鱸(Moronechrysops×Moronesaxatilis)、美國(guó)紅魚(yú)(Sciaenopsocellatus)和遲淑艷等[40]在斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)試驗(yàn)中均證實(shí)精氨酸對(duì)腸道健康具有重要意義。同樣，在腸道組織中，蛋氨酸通過(guò)轉(zhuǎn)甲基可生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM脫去羧基可生成5′-腺苷甲基硫丙胺，該物質(zhì)將氨丙基轉(zhuǎn)移給腐胺或亞精胺也生成多胺[41]，蛋氨酸還通過(guò)轉(zhuǎn)硫作用生成谷胱甘肽的底物半胱氨酸，因此蛋氨酸可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)含量及細(xì)胞存活，而GSH也具有保護(hù)腸上皮細(xì)胞等重要作用[42]。彭艷等[43]研究證實(shí)，蛋氨酸可促進(jìn)幼建鯉腸道發(fā)育及增加皺壁高度。本試驗(yàn)中對(duì)照組和試驗(yàn)組均有一定比例的腸道損傷現(xiàn)象，對(duì)照組的腸道損傷可能與飼料中豆粕含量較高，飼料中大豆抗原的水平較J5和J10組高[44]，并且內(nèi)源蛋氨酸相對(duì)缺乏有關(guān)；J10組的腸道損傷可能是由于內(nèi)源精氨酸缺乏所致，而乙醇梭菌蛋白替代豆粕后降低了飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平，所以緩減了J5和J10組后腸組織損傷程度。

然而，當(dāng)隨著乙醇梭菌蛋白添加量增加，草魚(yú)肝胰臟組織病變的比例呈升高趨勢(shì)，J10組血漿AST/ALT異常升高。彭艷等[43]發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸對(duì)幼建鯉肝胰臟生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用；Li等[45]研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸可能通過(guò)降低肝促炎性細(xì)胞因子和自由基的釋放來(lái)保護(hù)肝臟。本試驗(yàn)中由于草魚(yú)可能對(duì)外源添加氨基酸的吸收利用能力不足[46]，導(dǎo)致各組實(shí)際吸收利用的蛋氨酸和J10組實(shí)際吸收利用的精氨酸不足，從而各組均有肝臟損傷狀況出現(xiàn)[47-48]，并且本研究用乙醇梭菌蛋白為新開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)源，在開(kāi)發(fā)過(guò)程中可能存在潛在未知因素，導(dǎo)致肝胰臟病變的比例隨乙醇梭桿菌蛋白添加量增加而升高，Kiessling等[49]在菌體蛋白部分替代魚(yú)粉飼喂虹鱒的試驗(yàn)中有過(guò)類(lèi)似報(bào)道，目前相關(guān)報(bào)道較少，需要經(jīng)進(jìn)一步研究及生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)才能明確其具體原因。唐炳榮[50]報(bào)道，蛋氨酸能夠降低血清中的ALT活性，同時(shí)提高肝胰臟中的AST、ALT活性；魏祥云[51]研究表明，肝臟受損時(shí)，AST從線(xiàn)粒體大量釋入血。本試驗(yàn)中，J0、J5、J10組內(nèi)源性結(jié)合態(tài)蛋氨酸遞增，可能是血漿ALT活性逐漸降低的原因，導(dǎo)致J10組血漿AST/ALT異常升高，提示肝胰臟功能有可能受損，這可能是導(dǎo)致J10組存活率下降的主要原因。此外，肝臟代謝障礙，也可能與高蛋白質(zhì)含量的乙醇梭菌蛋白替代豆粕后導(dǎo)致J10組中淀粉含量增加有關(guān)。

此外，廖英杰等[52]報(bào)道，適量范圍內(nèi)增加精氨酸含量可以提高團(tuán)頭魴幼魚(yú)血細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性,同時(shí)降低感染嗜水氣單胞菌后累計(jì)死亡率；趙紅霞等[53]也研究表明，軍曹魚(yú)幼魚(yú)的存活率在一定范圍類(lèi)隨飼料中精氨酸含量升高而升高。這說(shuō)明J10組內(nèi)源精氨酸缺乏可能也是直接導(dǎo)致其存活率低另一個(gè)原因。

4 結(jié) 論

飼料中添加5%乙醇梭菌蛋白替代27.5%的豆粕可以有效提高飼料效率、增重率和特定生長(zhǎng)率，降低血漿TC、MDA含量，改善脂肪代謝和抗氧化能力，同時(shí)有利于腸道組織健康，從而提高生長(zhǎng)性能，在此范圍內(nèi)使用安全有效;而進(jìn)一步提高乙醇梭菌蛋白添加量至10%則造成肝細(xì)胞損傷，肝臟功能受損，存活率降低。本試驗(yàn)中，建議乙醇梭菌蛋白在草魚(yú)飼料中添加量為5%。