衛(wèi)愛蓮 代張超 魯 陳 丁小玲 刁 歡 閆一博 李呂木

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥230036)

鋅是動(dòng)植物及人類重要的必需微量金屬元素，參與體內(nèi)多種生化反應(yīng)，如蛋白質(zhì)的合成、DNA和RNA的代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[1]。不僅如此，鋅還在促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、免疫[2]、繁殖及腦神經(jīng)等方面起著重要的作用[3]。并且動(dòng)物年齡越小，鋅對(duì)動(dòng)物的影響越大[4]。仔豬缺鋅可導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻，皮膚出現(xiàn)不全角化癥[5]。研究還發(fā)現(xiàn)，飼喂高于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要量的高鋅飼糧，對(duì)雞[6]、羊[7]、豬[8]等動(dòng)物具有促生長(zhǎng)作用，因而生產(chǎn)上普遍采用高鋅飼糧[9]。由于無機(jī)鋅價(jià)格低廉，硫酸鋅(ZnSO4)等無機(jī)鋅是常用的飼糧鋅營(yíng)養(yǎng)源。但用無機(jī)鋅作為鋅源，其吸收利用率低[10-11]且易造成環(huán)境的污染，所以尋找新的鋅源迫在眉睫。因此，利用率較高的微生物鋅受到了廣泛重視。郭雪娜等[12]在402株酵母菌中篩選到了1株可以將硫酸鋅高效轉(zhuǎn)化為酵母鋅的菌株，其鋅含量可達(dá)9.3 mg/g。李宇興等[13]篩選的富鋅酵母，對(duì)無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率達(dá)50%。Cha等[14]比較了釀酒酵母菌FF-10對(duì)氯化鋅、氧化鋅和硫酸鋅等不同無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅的效果，發(fā)現(xiàn)氯化鋅轉(zhuǎn)化效率更高。大鼠飼喂試驗(yàn)表明，酵母鋅的利用率要高于硫酸鋅[15]。隨著國(guó)家不斷加大環(huán)境保護(hù)的力度，為提高鋅的在動(dòng)物體內(nèi)的利用率，降低糞尿中鋅殘留量，一些利用率高的鋅源，如氨基酸螯合鋅[16]等更受歡迎，但是由于其價(jià)格較高而限制了其在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用。因此，研發(fā)價(jià)格低廉、制備方法簡(jiǎn)單的微生物鋅源顯得尤為必要。為此，本研究擬從實(shí)驗(yàn)室保存的飼用菌種中篩選出高效轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅為微生物鋅的菌株，以期開發(fā)出價(jià)格相對(duì)低廉的微生物鋅，為綠色畜牧業(yè)的發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用的16株飼用菌種，其編號(hào)分別為2、3、4、6、8、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、58，均為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株，其中乳酸菌1株，酵母菌12株，芽孢桿菌3株。鋅標(biāo)準(zhǔn)液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)、硫酸鋅(西隴科學(xué)股份有限公司)、葡萄糖(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)均為分析純。試驗(yàn)雞為健康的18周齡的海蘭褐公雞，購(gòu)自安徽省合肥市長(zhǎng)豐縣安禽禽業(yè)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，土豆200 g，pH自然，水1 L，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基

牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 L，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.3 乳酸細(xì)菌(MRS)培養(yǎng)基

蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二胺2 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，七水硫酸鎂0.2 g，七水硫酸錳0.05 g，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.4 無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

在YPD、NB和MRS培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的硫酸鋅，以上培養(yǎng)基的滅菌條件為121 ℃、15 min。

1.3 主要儀器

火焰原子吸收光譜儀(ZEEnit700p，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)、高速冷凍離心機(jī)(JW-3021HR，安徽嘉文裝備有限公司)、恒溫?fù)u床(ZHP-250，上海三發(fā)科技有限公司)、烘箱(DGT-G82A，合肥達(dá)斯卡特科學(xué)有限公司)、消化爐(ML-3-4，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.4 鋅含量的測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照GB/T 5009.14—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鋅的測(cè)定》[17]中火焰原子吸收吸收光譜法繪制鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：

Y=0.3026x+0.0127。

1.4.2 微生物鋅含量的測(cè)定

待測(cè)培養(yǎng)液4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用超純水配制0.9%的生理鹽水，洗滌3次后收集菌體，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，參照GB/T 5009.14—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鋅的測(cè)定》[17]進(jìn)行消化分解，再稀釋5、10、20倍進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。

1.5 富鋅微生物的篩選

取備選菌種按照各自的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件培養(yǎng)好后，分別接種到100 mL對(duì)應(yīng)的PDA、NB和MRS液體培養(yǎng)基中，酵母菌于28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，芽孢桿菌于37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)1 d，乳酸菌于37 ℃靜止培養(yǎng)2 d。然后在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行3次純化，挑取菌株接入無機(jī)鋅濃度為2 mg/L的對(duì)應(yīng)的PDA、NB和MRS液體培養(yǎng)基中，酵母菌培養(yǎng)和芽孢桿菌培養(yǎng)3 d，乳酸菌培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)結(jié)束用高速冷凍離心機(jī)對(duì)菌液進(jìn)行離心(4 000 r/min、5 min)，棄去上清液，再用去離子水沖洗3遍后在透析袋中透析，直至上清液中檢測(cè)不出鋅離子，再離心收集沉淀得到菌體，然后在60 ℃的烘箱中烘干至恒重[18]。以微生物轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率為依據(jù)，篩選出對(duì)無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化率高的菌株。

1.6 目標(biāo)菌種培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

對(duì)無機(jī)鋅濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和菌液接種量4個(gè)因素依次進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)菌種對(duì)無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅轉(zhuǎn)化率的高低，篩選出最佳轉(zhuǎn)化率的組合參數(shù)。以上一次篩選的最優(yōu)轉(zhuǎn)化率因素作為下一次最優(yōu)轉(zhuǎn)化率因素篩選時(shí)的條件。

1.6.1 無機(jī)鋅濃度的優(yōu)化

設(shè)置5個(gè)無機(jī)鋅濃度，分別為2、4、6、8和10 mg/L，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)，菌液接種量為2%，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.6.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

設(shè)置5個(gè)培養(yǎng)溫度，分別為26、27、28、29和30 ℃，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)，無機(jī)鋅濃度為1.6.1所確定的無機(jī)鋅濃度，其余條件與1.6.1相同。

1.6.3 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

設(shè)置5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間，分別為48、66、72、84和96 h，每個(gè)處理2重復(fù)，培養(yǎng)溫度為1.6.2所確定的培養(yǎng)溫度，其余條件與1.6.2相同。

1.6.4 菌液接種量的優(yōu)化

設(shè)置5個(gè)菌液接種量，分別為1%、2%、3%、4%和5%，每個(gè)處理2重復(fù)，培養(yǎng)時(shí)間為1.6.3所確定的培養(yǎng)時(shí)間，其余條件與1.6.3相同。

1.7 目標(biāo)菌種培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)設(shè)計(jì),對(duì)無機(jī)鋅濃度(A)、培養(yǎng)溫度(B)、培養(yǎng)時(shí)間(C)和菌液接種量(D)4因素進(jìn)行3水平正交優(yōu)化，進(jìn)一步確定其將無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅的最佳組合條件，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。各因素水平為：無機(jī)鋅濃度分別為1.5、2.0和2.5 mg/L，培養(yǎng)溫度分別為27.5、28.0和28.5 ℃，培養(yǎng)時(shí)間分別為66、72和78 h，菌液接種量分別為2%、3%和4%。

1.8 無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化微生物鋅的轉(zhuǎn)化率計(jì)算

微生物轉(zhuǎn)化后菌體中的含鋅量與培養(yǎng)基中添加的無機(jī)鋅含量的百分比即為無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率，其計(jì)算公式為：

轉(zhuǎn)化率(%)=100×微生物轉(zhuǎn)化后菌體中的含鋅量/為培養(yǎng)基中添加的無機(jī)鋅含量。

1.9 酵母鋅飼喂雞的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)評(píng)定

將20只健康的18周齡的海蘭褐公雞隨機(jī)分4組，即2個(gè)對(duì)照組和2個(gè)試驗(yàn)組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只，單籠飼養(yǎng)，各組間體重差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組1和對(duì)照組2飼喂無機(jī)鋅(ZnSO4·7H2O)，飼糧鋅含量分別為60和90 mg/kg；試驗(yàn)組1和試驗(yàn)2組飼喂酵母鋅(為上述菌種轉(zhuǎn)化的富鋅酵母菌)，飼糧鋅含量也分別為60和90 mg/kg。預(yù)試期和正試期各5 d，每只雞日定量飼喂100 g，于08:00和16:00分2次飼喂。采用全收糞法[19]測(cè)定飼糧鋅的表觀代謝率，進(jìn)而計(jì)算出酵母鋅中的鋅相對(duì)于硫酸鋅中鋅的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)。試驗(yàn)在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物代謝室進(jìn)行，采用玉米-豆粕型飼糧，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，微量元素預(yù)混料組成見表2。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

每千克復(fù)合維生素含 Per kg multi-vitamin contained: VA 7 000 IU，VD38 000 IU，VE 30 IU，VC 5 mg，VB113 mg，VB230 mg，VB63 mg，葉酸 folic acid 3 mg，泛酸 pantothenic acid 20 mg，煙酸 nicotinic acid 30 mg。

表2 微量元素預(yù)混料組成

酵母鋅中鋅含量 Zinc content of yeast zinc：11.396 mg/g。

鋅的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)的有關(guān)公式為：

每日鋅食入量(g)=每日采食量×飼糧中鋅含量；每日糞尿鋅排出量(g)=每日糞尿排出量×糞尿中鋅含量；每日鋅存留量(g)=每日鋅食入量-每日糞尿鋅排出量；對(duì)照組食入鋅增量(g)=對(duì)照組2食入鋅量-對(duì)照組1食入鋅量；對(duì)照組鋅存留增量(g)=對(duì)照組2鋅存留增量-對(duì)照組1鋅存留增量；試驗(yàn)組食入鋅增量(g)=試驗(yàn)組2食入鋅量-試驗(yàn)組1食入鋅量；試驗(yàn)組鋅存留增量(g)=試驗(yàn)組2鋅存留增量-試驗(yàn)組1鋅存留增量；鋅生物學(xué)利用率(%)=100×鋅存留增量/食入鋅增量；鋅的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)(%)=100×試驗(yàn)組鋅生物學(xué)利用率/對(duì)照組鋅生物學(xué)利用率。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)先用Excel 2007進(jìn)行整理，再用SPSS 20.0進(jìn)行分析。單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及極差分析。所有試驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

從表3中可以看出，58號(hào)菌種(釀酒酵母菌)轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了52.68%。因此，以58號(hào)菌種進(jìn)行后續(xù)的研究，以下皆稱該菌種為釀酒酵母菌。

2.2 單因素優(yōu)化

2.2.1 無機(jī)鋅濃度對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

從表4中可以看出，釀酒酵母菌對(duì)無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率隨著無機(jī)鋅濃度的增加而逐漸降低，當(dāng)無機(jī)鋅濃度為2 mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了64.48%，顯著高于其他各組(P<0.05)。這說明無機(jī)鋅濃度為2 mg/L時(shí)，釀酒酵母菌的富鋅能力最好。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

從表4中可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，釀酒酵母菌對(duì)無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率先逐漸升高再逐漸降低。28 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，為76.87%，與26和30 ℃時(shí)差異顯著(P<0.05)，與27和29 ℃組差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇28 ℃作為釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅的培養(yǎng)條件。

2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

從表4中可以看出，培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，釀酒酵母菌對(duì)無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到78.18%，顯著高于48和66 h(P<0.05)，然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)化率差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅的培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

2.2.4 菌液接種量對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

從表4中可以看出，隨著菌液接種量的增加，釀酒酵母菌對(duì)無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率先逐漸升高后降低，菌液接種量為4%時(shí)，釀酒酵母菌對(duì)無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了78.57%，顯著高于菌液接種量為1%和2%時(shí)(P<0.05)。隨后再增加菌液接種量，釀酒酵母菌對(duì)無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率不再增加，但與菌液接種量為3%時(shí)差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅的菌種接種量為4%。

由單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果可得知，釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅的最佳條件為：無機(jī)鋅濃度2 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h，菌液接種量4%。

表3 16株飼用微生物菌種轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率

表4 無機(jī)鋅濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和菌液接種量對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.3 正交優(yōu)化

從表5中可以看出，影響試驗(yàn)結(jié)果因素的先后順序?yàn)椋篈>B>D>C，即影響釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的因素依次為無機(jī)鋅濃度、培養(yǎng)溫度、菌液接種量和培養(yǎng)時(shí)間。由K值可得出最佳組合為：A1B2C1D3，即無機(jī)鋅濃度1.5 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間66 h，菌液接種量4%。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行正交的驗(yàn)證，其結(jié)果為無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率達(dá)98.01%，高于所有正交試驗(yàn)的所有組合，證明該組合即為釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅的最優(yōu)組合條件。

從表6中可以看出，無機(jī)鋅濃度、培養(yǎng)時(shí)間和菌液接種量對(duì)轉(zhuǎn)化率有極顯著的影響(P<0.01)，培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率有顯著的影響(P<0.05)，各因素3水平之間差異顯著(P<0.05)。

2.4 酵母鋅飼喂雞的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)評(píng)定

從表7中可以看出，酵母鋅中鋅的生物學(xué)利用率比硫酸鋅高10.33%，其相對(duì)于硫酸鋅中鋅的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)為114.83%，表明該酵母鋅是優(yōu)于硫酸鋅的一種鋅添加劑。

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的極差分析

表6 Duncan氏多重比較結(jié)果

**表示因素各水平多重比較時(shí)差異極顯著(P<0.01)，*表示因素各水平多重比較時(shí)差異顯著(P<0.05)，同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

** indicated extremely significant differences at each level of multiple comparisons (P<0.01), * indicated significant differences at each level of multiple factor comparisons (P<0.05), and values the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

表7 酵母鋅中鋅的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)

3 討 論

3.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

不同的微生物對(duì)微量元素的吸附機(jī)制和吸附能力不同，所以在選用微生物轉(zhuǎn)化無機(jī)微量元素來改善微量元素的利用率時(shí)，菌種的選擇就顯得尤為重要，常常要根據(jù)吸附的元素不同來選擇不同的微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化微量元素。與此同時(shí)，微量元素的濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、菌液接種量等也對(duì)微生物轉(zhuǎn)化無機(jī)微量元素的能力有著重要的影響[20]。

3.1.1 無機(jī)鋅濃度對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

無機(jī)鋅濃度對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅的能力有較大的影響，本試驗(yàn)最佳的無機(jī)鋅濃度為1.5 mg/L，此條件下轉(zhuǎn)化率達(dá)到了98.01%。無機(jī)鋅濃度主要影響釀酒酵母菌的活力，當(dāng)無機(jī)鋅濃度過高，可能影響酵母菌的繁殖力，這是因?yàn)榻饘僭啬芘c釀酒酵母菌中的蛋白質(zhì)結(jié)合，使其變性失活，破壞蛋白質(zhì)的正常生理功能[19]，從而抑制了釀酒酵母菌的生長(zhǎng)；無機(jī)鋅濃度過低時(shí)，不能滿足釀酒酵母菌的營(yíng)養(yǎng)需要，使其生長(zhǎng)延長(zhǎng)[21]。楊靖鵬[22]研究表明，無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅的轉(zhuǎn)化率為69.25%，低于本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化率，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)的無機(jī)鋅濃度較低，有利于釀酒酵母菌將無機(jī)鋅盡可能多的轉(zhuǎn)化為微生物鋅，提高無機(jī)鋅的利用率，減少無機(jī)鋅對(duì)環(huán)境的污染。

3.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

培養(yǎng)溫度影響微生物的生長(zhǎng)，酵母在25～32 ℃均可生長(zhǎng)，但在不同的溫度下其生長(zhǎng)的速度和合成的有機(jī)物不同，因此要根據(jù)轉(zhuǎn)化的微量元素選擇合適的溫度。在富集轉(zhuǎn)化的過程中，溫度過高會(huì)使釀酒酵母菌中的磷脂分子在膜內(nèi)進(jìn)行快速的側(cè)向擴(kuò)散，增加膜脂的流動(dòng)性，破壞膜的完整性，從而導(dǎo)致釀酒酵母菌的存活率下降[23]。本試驗(yàn)所篩選的培養(yǎng)溫度與康毅等[24]所研究的釀酒酵母菌需要的溫度條件是相同的。

3.1.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅的能力有較大的影響，培養(yǎng)時(shí)間會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)及其對(duì)無機(jī)鋅富集轉(zhuǎn)化量的多少，培養(yǎng)時(shí)間過短，釀酒酵母菌未生長(zhǎng)完全；培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，釀酒酵母菌會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，從而抑制其增長(zhǎng)。本試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)時(shí)間與Chreptowicz等[25]所篩選酵母所需的培養(yǎng)時(shí)間是一樣的。

3.1.4 菌液接種量對(duì)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅能力的影響

菌液接種量主要影響無機(jī)鋅向微生物鋅轉(zhuǎn)化的速率，菌液接種量過低，微生物生長(zhǎng)緩慢，雜菌污染率增加，轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)；菌液接種量過高，微生物生長(zhǎng)迅速，在短時(shí)間內(nèi)積聚大量代謝副產(chǎn)物，抑制微生物活性物質(zhì)的合成[26]。本試驗(yàn)的菌液接種量為4%，低于孔林[27]研究的菌液接種量，可能的原因是本試驗(yàn)的菌液濃度高于其菌液濃度。

3.2 酵母鋅飼喂雞的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)評(píng)定

在集約化飼養(yǎng)的模式下，動(dòng)物在生產(chǎn)過程中會(huì)集中排泄大量的糞便和尿液，給環(huán)境造成了巨大污染，其中微量元素的大量排出對(duì)環(huán)境造成不可逆的損害，不僅如此，對(duì)動(dòng)物本身和周圍植物也造成了一定程度的損傷。其中鋅在動(dòng)物生產(chǎn)中的排放不僅僅與飼糧中添加水平密切相關(guān)[28]，也與動(dòng)物自身對(duì)鋅的利用率有關(guān)，即與鋅的生物學(xué)效價(jià)有密切的關(guān)系[29]。因此，提高鋅的利用率對(duì)動(dòng)物本身和環(huán)境均有益。本研究篩選出的富鋅酵母不僅對(duì)無機(jī)鋅具有較高的轉(zhuǎn)化率，并且其飼喂雞可以顯著提高雞對(duì)鋅的生物學(xué)利用率，減少糞中鋅排放，其鋅相對(duì)于無機(jī)硫酸鋅中鋅的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)高達(dá)114.83%，這一結(jié)果與其他微生物鋅的結(jié)果一致[30-31]，與索海青[31]測(cè)得的微生物鋅中鋅的相對(duì)硫酸鋅中鋅的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)為115%高度一致。

本試驗(yàn)中酵母鋅的利用率高于硫酸鋅，可能的原因是鋅被釀酒酵母菌富集在胞內(nèi)，以胞內(nèi)鋅的形式進(jìn)入動(dòng)物消化道，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易解離，并且能抵抗與其他配體如銅鋅結(jié)合蛋白等的干擾作用，以一種完整的結(jié)構(gòu)形式運(yùn)輸?shù)叫∧c的吸收部位，所以酵母鋅較硫酸鋅對(duì)動(dòng)物具有更高的生物學(xué)利用率，這可能符合有機(jī)鋅的內(nèi)源吸收假說[8]。大量研究表明，蛋氨酸鋅較硫酸鋅不但具有更高的生物利用率，而且還同時(shí)具有免疫和抗氧化活性[32-33]，但酵母鋅是否像蛋氨酸鋅一樣也具有免疫和抗氧化活性呢？這尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 釀酒酵母菌對(duì)無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)52.26%。

② 釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化無機(jī)鋅的最優(yōu)條件為：無機(jī)鋅濃度1.5 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間66 h，菌液接種量4%。該條件下，可將98.01%的無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為微生物鋅。

③ 以釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化的酵母鋅飼飼喂雞，相對(duì)與硫酸鋅中鋅，其鋅的利用率是114.83%。