衛(wèi)愛蓮 代張超 魯 陳 丁小玲 刁 歡 閆一博 李呂木

(安徽農業(yè)大學動物科技學院，合肥230036)

鋅是動植物及人類重要的必需微量金屬元素，參與體內多種生化反應，如蛋白質的合成、DNA和RNA的代謝、信號傳導、基因表達以及調節(jié)細胞的凋亡[1]。不僅如此，鋅還在促進動物的生長、免疫[2]、繁殖及腦神經等方面起著重要的作用[3]。并且動物年齡越小，鋅對動物的影響越大[4]。仔豬缺鋅可導致生長受阻，皮膚出現(xiàn)不全角化癥[5]。研究還發(fā)現(xiàn)，飼喂高于動物營養(yǎng)需要量的高鋅飼糧，對雞[6]、羊[7]、豬[8]等動物具有促生長作用，因而生產上普遍采用高鋅飼糧[9]。由于無機鋅價格低廉，硫酸鋅(ZnSO4)等無機鋅是常用的飼糧鋅營養(yǎng)源。但用無機鋅作為鋅源，其吸收利用率低[10-11]且易造成環(huán)境的污染，所以尋找新的鋅源迫在眉睫。因此，利用率較高的微生物鋅受到了廣泛重視。郭雪娜等[12]在402株酵母菌中篩選到了1株可以將硫酸鋅高效轉化為酵母鋅的菌株，其鋅含量可達9.3 mg/g。李宇興等[13]篩選的富鋅酵母，對無機鋅的轉化率達50%。Cha等[14]比較了釀酒酵母菌FF-10對氯化鋅、氧化鋅和硫酸鋅等不同無機鋅轉化為微生物鋅的效果，發(fā)現(xiàn)氯化鋅轉化效率更高。大鼠飼喂試驗表明，酵母鋅的利用率要高于硫酸鋅[15]。隨著國家不斷加大環(huán)境保護的力度，為提高鋅的在動物體內的利用率，降低糞尿中鋅殘留量，一些利用率高的鋅源，如氨基酸螯合鋅[16]等更受歡迎，但是由于其價格較高而限制了其在生產上的廣泛應用。因此，研發(fā)價格低廉、制備方法簡單的微生物鋅源顯得尤為必要。為此，本研究擬從實驗室保存的飼用菌種中篩選出高效轉化無機鋅為微生物鋅的菌株，以期開發(fā)出價格相對低廉的微生物鋅，為綠色畜牧業(yè)的發(fā)展做出積極貢獻。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與試驗動物

試驗所用的16株飼用菌種，其編號分別為2、3、4、6、8、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、58，均為本實驗室保存的菌株，其中乳酸菌1株，酵母菌12株，芽孢桿菌3株。鋅標準液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)、硫酸鋅(西隴科學股份有限公司)、葡萄糖(煙臺市雙雙化工有限公司)均為分析純。試驗雞為健康的18周齡的海蘭褐公雞，購自安徽省合肥市長豐縣安禽禽業(yè)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，土豆200 g，pH自然，水1 L，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.2 營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基

牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 L，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.3 乳酸細菌(MRS)培養(yǎng)基

蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二胺2 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，七水硫酸鎂0.2 g，七水硫酸錳0.05 g，若為固體培養(yǎng)基則加入20 g瓊脂。

1.2.4 無機鋅轉化培養(yǎng)基

在YPD、NB和MRS培養(yǎng)基中加入相應濃度的硫酸鋅，以上培養(yǎng)基的滅菌條件為121 ℃、15 min。

1.3 主要儀器

火焰原子吸收光譜儀(ZEEnit700p，德國耶拿分析儀器股份公司)、高速冷凍離心機(JW-3021HR，安徽嘉文裝備有限公司)、恒溫搖床(ZHP-250，上海三發(fā)科技有限公司)、烘箱(DGT-G82A，合肥達斯卡特科學有限公司)、消化爐(ML-3-4，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司)。

1.4 鋅含量的測定

1.4.1 標準曲線的繪制

按照GB/T 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》[17]中火焰原子吸收吸收光譜法繪制鋅標準曲線。標準曲線的線性回歸方程為：

Y=0.3026x+0.0127。

1.4.2 微生物鋅含量的測定

待測培養(yǎng)液4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用超純水配制0.9%的生理鹽水，洗滌3次后收集菌體，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，參照GB/T 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》[17]進行消化分解，再稀釋5、10、20倍進行上機測定。

1.5 富鋅微生物的篩選

取備選菌種按照各自的標準培養(yǎng)條件培養(yǎng)好后，分別接種到100 mL對應的PDA、NB和MRS液體培養(yǎng)基中，酵母菌于28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，芽孢桿菌于37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)1 d，乳酸菌于37 ℃靜止培養(yǎng)2 d。然后在固體培養(yǎng)基中進行3次純化，挑取菌株接入無機鋅濃度為2 mg/L的對應的PDA、NB和MRS液體培養(yǎng)基中，酵母菌培養(yǎng)和芽孢桿菌培養(yǎng)3 d，乳酸菌培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)結束用高速冷凍離心機對菌液進行離心(4 000 r/min、5 min)，棄去上清液，再用去離子水沖洗3遍后在透析袋中透析，直至上清液中檢測不出鋅離子，再離心收集沉淀得到菌體，然后在60 ℃的烘箱中烘干至恒重[18]。以微生物轉化無機鋅為微生物鋅的轉化率為依據，篩選出對無機鋅轉化率高的菌株。

1.6 目標菌種培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

對無機鋅濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和菌液接種量4個因素依次進行優(yōu)化，根據菌種對無機鋅轉化為微生物鋅轉化率的高低，篩選出最佳轉化率的組合參數(shù)。以上一次篩選的最優(yōu)轉化率因素作為下一次最優(yōu)轉化率因素篩選時的條件。

1.6.1 無機鋅濃度的優(yōu)化

設置5個無機鋅濃度，分別為2、4、6、8和10 mg/L，每個處理2個重復，菌液接種量為2%，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.6.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

設置5個培養(yǎng)溫度，分別為26、27、28、29和30 ℃，每個處理2個重復，無機鋅濃度為1.6.1所確定的無機鋅濃度，其余條件與1.6.1相同。

1.6.3 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

設置5個培養(yǎng)時間，分別為48、66、72、84和96 h，每個處理2重復，培養(yǎng)溫度為1.6.2所確定的培養(yǎng)溫度，其余條件與1.6.2相同。

1.6.4 菌液接種量的優(yōu)化

設置5個菌液接種量，分別為1%、2%、3%、4%和5%，每個處理2重復，培養(yǎng)時間為1.6.3所確定的培養(yǎng)時間，其余條件與1.6.3相同。

1.7 目標菌種培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)設計,對無機鋅濃度(A)、培養(yǎng)溫度(B)、培養(yǎng)時間(C)和菌液接種量(D)4因素進行3水平正交優(yōu)化，進一步確定其將無機鋅轉化為微生物鋅的最佳組合條件，每個處理3個重復。各因素水平為：無機鋅濃度分別為1.5、2.0和2.5 mg/L，培養(yǎng)溫度分別為27.5、28.0和28.5 ℃，培養(yǎng)時間分別為66、72和78 h，菌液接種量分別為2%、3%和4%。

1.8 無機鋅轉化微生物鋅的轉化率計算

微生物轉化后菌體中的含鋅量與培養(yǎng)基中添加的無機鋅含量的百分比即為無機鋅轉化為微生物鋅的轉化率，其計算公式為：

轉化率(%)=100×微生物轉化后菌體中的含鋅量/為培養(yǎng)基中添加的無機鋅含量。

1.9 酵母鋅飼喂雞的相對生物學效價評定

將20只健康的18周齡的海蘭褐公雞隨機分4組，即2個對照組和2個試驗組，每組5個重復，每個重復1只，單籠飼養(yǎng)，各組間體重差異不顯著(P>0.05)。對照組1和對照組2飼喂無機鋅(ZnSO4·7H2O)，飼糧鋅含量分別為60和90 mg/kg；試驗組1和試驗2組飼喂酵母鋅(為上述菌種轉化的富鋅酵母菌)，飼糧鋅含量也分別為60和90 mg/kg。預試期和正試期各5 d，每只雞日定量飼喂100 g，于08:00和16:00分2次飼喂。采用全收糞法[19]測定飼糧鋅的表觀代謝率，進而計算出酵母鋅中的鋅相對于硫酸鋅中鋅的相對生物學效價。試驗在安徽農業(yè)大學動物代謝室進行，采用玉米-豆粕型飼糧，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，微量元素預混料組成見表2。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

每千克復合維生素含 Per kg multi-vitamin contained: VA 7 000 IU，VD38 000 IU，VE 30 IU，VC 5 mg，VB113 mg，VB230 mg，VB63 mg，葉酸 folic acid 3 mg，泛酸 pantothenic acid 20 mg，煙酸 nicotinic acid 30 mg。

表2 微量元素預混料組成

酵母鋅中鋅含量 Zinc content of yeast zinc：11.396 mg/g。

鋅的相對生物學效價的有關公式為：

每日鋅食入量(g)=每日采食量×飼糧中鋅含量；每日糞尿鋅排出量(g)=每日糞尿排出量×糞尿中鋅含量；每日鋅存留量(g)=每日鋅食入量-每日糞尿鋅排出量；對照組食入鋅增量(g)=對照組2食入鋅量-對照組1食入鋅量；對照組鋅存留增量(g)=對照組2鋅存留增量-對照組1鋅存留增量；試驗組食入鋅增量(g)=試驗組2食入鋅量-試驗組1食入鋅量；試驗組鋅存留增量(g)=試驗組2鋅存留增量-試驗組1鋅存留增量；鋅生物學利用率(%)=100×鋅存留增量/食入鋅增量；鋅的相對生物學效價(%)=100×試驗組鋅生物學利用率/對照組鋅生物學利用率。

1.10 數(shù)據分析

數(shù)據先用Excel 2007進行整理，再用SPSS 20.0進行分析。單因素試驗數(shù)據進行單因素方差分析，正交試驗數(shù)據進行方差分析及極差分析。所有試驗結果均用平均值±標準差表示，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

從表3中可以看出，58號菌種(釀酒酵母菌)轉化無機鋅為微生物鋅的轉化率最高，達到了52.68%。因此，以58號菌種進行后續(xù)的研究，以下皆稱該菌種為釀酒酵母菌。

2.2 單因素優(yōu)化

2.2.1 無機鋅濃度對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

從表4中可以看出，釀酒酵母菌對無機鋅的轉化率隨著無機鋅濃度的增加而逐漸降低，當無機鋅濃度為2 mg/L時，轉化率最高，達到了64.48%，顯著高于其他各組(P<0.05)。這說明無機鋅濃度為2 mg/L時，釀酒酵母菌的富鋅能力最好。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

從表4中可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，釀酒酵母菌對無機鋅的轉化率先逐漸升高再逐漸降低。28 ℃時轉化率最高，為76.87%，與26和30 ℃時差異顯著(P<0.05)，與27和29 ℃組差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇28 ℃作為釀酒酵母菌轉化無機鋅的培養(yǎng)條件。

2.2.3 培養(yǎng)時間對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

從表4中可以看出，培養(yǎng)時間為72 h時，釀酒酵母菌對無機鋅的轉化率最高，達到78.18%，顯著高于48和66 h(P<0.05)，然后隨著培養(yǎng)時間的增加，轉化率差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇釀酒酵母菌轉化無機鋅的培養(yǎng)時間為72 h。

2.2.4 菌液接種量對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

從表4中可以看出，隨著菌液接種量的增加，釀酒酵母菌對無機鋅的轉化率先逐漸升高后降低，菌液接種量為4%時，釀酒酵母菌對無機鋅的轉化率最高，達到了78.57%，顯著高于菌液接種量為1%和2%時(P<0.05)。隨后再增加菌液接種量，釀酒酵母菌對無機鋅的轉化率不再增加，但與菌液接種量為3%時差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇釀酒酵母菌轉化無機鋅的菌種接種量為4%。

由單因素試驗設計結果可得知，釀酒酵母菌轉化無機鋅的最佳條件為：無機鋅濃度2 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時間72 h，菌液接種量4%。

表3 16株飼用微生物菌種轉化無機鋅為微生物鋅的轉化率

表4 無機鋅濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和菌液接種量對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

同列數(shù)據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.3 正交優(yōu)化

從表5中可以看出，影響試驗結果因素的先后順序為：A>B>D>C，即影響釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的因素依次為無機鋅濃度、培養(yǎng)溫度、菌液接種量和培養(yǎng)時間。由K值可得出最佳組合為：A1B2C1D3，即無機鋅濃度1.5 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時間66 h，菌液接種量4%。在此最優(yōu)條件下進行正交的驗證，其結果為無機鋅的轉化率達98.01%，高于所有正交試驗的所有組合，證明該組合即為釀酒酵母菌轉化無機鋅的最優(yōu)組合條件。

從表6中可以看出，無機鋅濃度、培養(yǎng)時間和菌液接種量對轉化率有極顯著的影響(P<0.01)，培養(yǎng)溫度對轉化率有顯著的影響(P<0.05)，各因素3水平之間差異顯著(P<0.05)。

2.4 酵母鋅飼喂雞的相對生物學效價評定

從表7中可以看出，酵母鋅中鋅的生物學利用率比硫酸鋅高10.33%，其相對于硫酸鋅中鋅的相對生物學效價為114.83%，表明該酵母鋅是優(yōu)于硫酸鋅的一種鋅添加劑。

表5 正交試驗設計結果的極差分析

表6 Duncan氏多重比較結果

**表示因素各水平多重比較時差異極顯著(P<0.01)，*表示因素各水平多重比較時差異顯著(P<0.05)，同行數(shù)據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

** indicated extremely significant differences at each level of multiple comparisons (P<0.01), * indicated significant differences at each level of multiple factor comparisons (P<0.05), and values the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

表7 酵母鋅中鋅的相對生物學效價

3 討 論

3.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

不同的微生物對微量元素的吸附機制和吸附能力不同，所以在選用微生物轉化無機微量元素來改善微量元素的利用率時，菌種的選擇就顯得尤為重要，常常要根據吸附的元素不同來選擇不同的微生物進行轉化微量元素。與此同時，微量元素的濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、菌液接種量等也對微生物轉化無機微量元素的能力有著重要的影響[20]。

3.1.1 無機鋅濃度對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

無機鋅濃度對釀酒酵母菌轉化無機鋅的能力有較大的影響，本試驗最佳的無機鋅濃度為1.5 mg/L，此條件下轉化率達到了98.01%。無機鋅濃度主要影響釀酒酵母菌的活力，當無機鋅濃度過高，可能影響酵母菌的繁殖力，這是因為金屬元素能與釀酒酵母菌中的蛋白質結合，使其變性失活，破壞蛋白質的正常生理功能[19]，從而抑制了釀酒酵母菌的生長；無機鋅濃度過低時，不能滿足釀酒酵母菌的營養(yǎng)需要，使其生長延長[21]。楊靖鵬[22]研究表明，無機鋅轉化為微生物鋅的轉化率為69.25%，低于本試驗的轉化率，這可能是因為本試驗的無機鋅濃度較低，有利于釀酒酵母菌將無機鋅盡可能多的轉化為微生物鋅，提高無機鋅的利用率，減少無機鋅對環(huán)境的污染。

3.1.2 培養(yǎng)溫度對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

培養(yǎng)溫度影響微生物的生長，酵母在25～32 ℃均可生長，但在不同的溫度下其生長的速度和合成的有機物不同，因此要根據轉化的微量元素選擇合適的溫度。在富集轉化的過程中，溫度過高會使釀酒酵母菌中的磷脂分子在膜內進行快速的側向擴散，增加膜脂的流動性，破壞膜的完整性，從而導致釀酒酵母菌的存活率下降[23]。本試驗所篩選的培養(yǎng)溫度與康毅等[24]所研究的釀酒酵母菌需要的溫度條件是相同的。

3.1.3 培養(yǎng)時間對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

培養(yǎng)時間對釀酒酵母菌轉化無機鋅的能力有較大的影響，培養(yǎng)時間會影響微生物的生長及其對無機鋅富集轉化量的多少，培養(yǎng)時間過短，釀酒酵母菌未生長完全；培養(yǎng)時間過長，釀酒酵母菌會產生副產物，從而抑制其增長。本試驗篩選出的培養(yǎng)時間與Chreptowicz等[25]所篩選酵母所需的培養(yǎng)時間是一樣的。

3.1.4 菌液接種量對釀酒酵母菌轉化無機鋅能力的影響

菌液接種量主要影響無機鋅向微生物鋅轉化的速率，菌液接種量過低，微生物生長緩慢，雜菌污染率增加，轉化時間延長；菌液接種量過高，微生物生長迅速，在短時間內積聚大量代謝副產物，抑制微生物活性物質的合成[26]。本試驗的菌液接種量為4%，低于孔林[27]研究的菌液接種量，可能的原因是本試驗的菌液濃度高于其菌液濃度。

3.2 酵母鋅飼喂雞的相對生物學效價評定

在集約化飼養(yǎng)的模式下，動物在生產過程中會集中排泄大量的糞便和尿液，給環(huán)境造成了巨大污染，其中微量元素的大量排出對環(huán)境造成不可逆的損害，不僅如此，對動物本身和周圍植物也造成了一定程度的損傷。其中鋅在動物生產中的排放不僅僅與飼糧中添加水平密切相關[28]，也與動物自身對鋅的利用率有關，即與鋅的生物學效價有密切的關系[29]。因此，提高鋅的利用率對動物本身和環(huán)境均有益。本研究篩選出的富鋅酵母不僅對無機鋅具有較高的轉化率，并且其飼喂雞可以顯著提高雞對鋅的生物學利用率，減少糞中鋅排放，其鋅相對于無機硫酸鋅中鋅的相對生物學效價高達114.83%，這一結果與其他微生物鋅的結果一致[30-31]，與索海青[31]測得的微生物鋅中鋅的相對硫酸鋅中鋅的相對生物學效價為115%高度一致。

本試驗中酵母鋅的利用率高于硫酸鋅，可能的原因是鋅被釀酒酵母菌富集在胞內，以胞內鋅的形式進入動物消化道，其結構穩(wěn)定，不易解離，并且能抵抗與其他配體如銅鋅結合蛋白等的干擾作用，以一種完整的結構形式運輸?shù)叫∧c的吸收部位，所以酵母鋅較硫酸鋅對動物具有更高的生物學利用率，這可能符合有機鋅的內源吸收假說[8]。大量研究表明，蛋氨酸鋅較硫酸鋅不但具有更高的生物利用率，而且還同時具有免疫和抗氧化活性[32-33]，但酵母鋅是否像蛋氨酸鋅一樣也具有免疫和抗氧化活性呢？這尚待進一步研究。

4 結 論

① 釀酒酵母菌對無機鋅的轉化率最高，可達52.26%。

② 釀酒酵母菌轉化無機鋅的最優(yōu)條件為：無機鋅濃度1.5 mg/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時間66 h，菌液接種量4%。該條件下，可將98.01%的無機鋅轉化為微生物鋅。

③ 以釀酒酵母菌轉化的酵母鋅飼飼喂雞，相對與硫酸鋅中鋅，其鋅的利用率是114.83%。