李燁青 奚雨萌 曾涵芳 張 林 陳孟姣 韓兆玉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京210095)

瘤胃是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，內(nèi)含多種多樣的古細(xì)菌、真菌及原蟲等，它們?cè)诰S持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和影響奶牛健康方面起關(guān)鍵作用。這些瘤胃微生物具有高度特異性，它們消化代謝產(chǎn)生的能量可以被奶牛利用，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化起著關(guān)鍵的作用，還可能會(huì)提高宿主對(duì)入侵的病原體的抵抗力[1]。細(xì)菌是瘤胃中數(shù)量最多的一種微生物，其中分解粗飼料中的纖維物質(zhì)主要是靠纖維素分解菌，如絲桿菌(Fibrobacter)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)等。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)具有很強(qiáng)的分解纖維素能力，其發(fā)酵產(chǎn)物有乙酸和琥珀酸，這種菌對(duì)抗生素也有很強(qiáng)的耐受力。另外，擬桿菌門(Bacteroidetes)中的普雷沃氏菌屬(Prevotella)是瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬，它們可以分解蛋白質(zhì)、淀粉、多糖，但不能分解纖維素。總之，多種微生物相互作用、相互制約，共同維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對(duì)于促進(jìn)奶牛消化代謝、維持奶牛健康、提高生產(chǎn)性能具有重要意義。因此，對(duì)瘤胃微生物區(qū)系變化的研究是十分必要的。

產(chǎn)氣法是應(yīng)用較廣、操作較簡(jiǎn)單、重復(fù)性較高的體外發(fā)酵方法之一，常用來評(píng)價(jià)飼料消化率、評(píng)估飼料添加劑效果等。大多數(shù)體外發(fā)酵試驗(yàn)研究底物精粗比和添加劑等對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響[2-6]，但是在正常飼糧作為發(fā)酵底物時(shí)，用體外發(fā)酵法研究瘤胃微生物區(qū)系隨時(shí)間變化的報(bào)道較少。因此，了解產(chǎn)氣法系統(tǒng)帶來的瘤胃微生物區(qū)系變化，完善現(xiàn)有條件下的科研工作具有現(xiàn)實(shí)意義。

16S rRNA是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中，具有高度的保守性和特異性。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA測(cè)序已經(jīng)成為分析微生物區(qū)系組成、研究生態(tài)系統(tǒng)多樣性的重要方法，其準(zhǔn)確性、全面性、精確性遠(yuǎn)優(yōu)于其他傳統(tǒng)的技術(shù)[7]。本試驗(yàn)旨在使用16S rRNA測(cè)序技術(shù)，分析奶牛體外發(fā)酵瘤胃微生物區(qū)系隨時(shí)間推移的變化規(guī)律，為探究瘤胃微生物繁殖規(guī)律及完善體外發(fā)酵分析方法提供支持。

1 材料與方法

1.1 體外發(fā)酵產(chǎn)氣系統(tǒng)建立

發(fā)酵底物為江蘇省南京西崗奶牛場(chǎng)提供的全混合日糧，精粗比為50∶50，經(jīng)烘干粉碎后，過20目篩，待用，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

發(fā)酵液采用新鮮瘤胃液與人工唾液混合而成。新鮮瘤胃液選自3頭泌乳中期的成年健康荷斯坦奶牛。具體方法為：在晨飼2 h后，通過瘤胃瘺管接取足量的瘤胃液，4層紗布過濾，灌入充滿CO2并經(jīng)過預(yù)熱達(dá)39 ℃的保溫瓶，灌滿后把瓶口立即蓋緊，送回實(shí)驗(yàn)室，再經(jīng)4層紗布過濾，磁力攪拌器混勻，待用。整個(gè)過程持續(xù)通入CO2維持厭氧環(huán)境。人工唾液參照Theodorou等[8]方法配制，人工唾液組成見表2。每升人工唾液配制過程為：在558.9 mL蒸餾水中加入0.1 mL溶液A、200 mL溶液B、200 mL溶液C及1 mL溶液D，通入CO2飽和后放置于39 ℃并恒溫水浴5～6 h，加入40 mL溶液E，混勻后通入CO2至飽和并加熱至39 ℃，繼續(xù)通CO20.5～1.0 h，使人工唾液變?yōu)闊o色，待用。將備好的瘤胃液與人工唾液在厭氧條件下充分混合(體積比1∶9)，pH調(diào)至6.7，39 ℃恒溫，作為發(fā)酵液。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 13.5 kIU，VD33.78 kIU，VE 54 kIU，Cu 20 mg，F(xiàn)e 29 mg，Mn 26 mg，Zn 92.75 mg，I 2.16 mg，Se 0.59 mg，Co 0.14 mg。

2)產(chǎn)奶凈能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。NELwas a calculated value, while others were measured values.

本試驗(yàn)使用160 mL無菌玻璃瓶為發(fā)酵瓶，每個(gè)發(fā)酵瓶中稱取1 g發(fā)酵底物，持續(xù)通入30 s CO2后，使用全自動(dòng)分裝儀進(jìn)行快速分裝，每瓶100 mL發(fā)酵液，然后迅速加蓋異丁基塑膠塞，并以鋁蓋密封，搖勻后置于39 ℃的培養(yǎng)箱搖床中恒溫培養(yǎng)48 h。

表2 人工唾液組成

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。分別于培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后取出培養(yǎng)瓶，放入冰水浴中使發(fā)酵停止，并分別吸取2 mL發(fā)酵液置于凍存管，密封后液氮保存。本試驗(yàn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，共15個(gè)樣品。同時(shí)，另取3個(gè)培養(yǎng)瓶，只加入人工唾液進(jìn)行培養(yǎng)，用于設(shè)備參數(shù)校正。

1.3 累積產(chǎn)氣量的測(cè)定

培養(yǎng)期間分別在6、12、24、48 h測(cè)定并記錄體外發(fā)酵產(chǎn)氣量，根據(jù)朱偉云等[9]的方法，使用氣壓轉(zhuǎn)換器(IGER，UK)定時(shí)測(cè)定厭氧瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)氣量，根據(jù)各產(chǎn)氣量和氣壓進(jìn)行校正，除去空白發(fā)酵瓶產(chǎn)氣量，計(jì)算出累積產(chǎn)氣量。

1.4 16S rRNA測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

首先對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行提取、PCR擴(kuò)增和純化，然后構(gòu)建Miseq文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序。接著根據(jù)index和barcode序列區(qū)分各樣本數(shù)據(jù)，且對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)有效數(shù)據(jù)和確定優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度分布。利用QIIME軟件，使用RDP分類器[9]以Silva、RDP、Greengene細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)[10]為參比，對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)分類，分類基于Bergey’s taxonomy，共分為6級(jí)，依次為界(kingdom)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)，默認(rèn)閾值為80%。統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在門和屬水平上群落組成，繪制系統(tǒng)分類柱狀圖，并采用gplots軟件繪制瘤胃微生物群落熱圖[11]。最后，利用USEARCH軟件[12]，并基于操作分類單位(OTU)[13]進(jìn)行物種多樣性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 17.0軟件ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序質(zhì)量與合理性

對(duì)不同樣本DNA進(jìn)行16S rRNA V3～V4區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增的條帶大小正確，濃度合適且條帶單一，說明純化后基因組DNA中無抑制PCR反應(yīng)的雜質(zhì)，可基于16S rRNA基因序列分析微生物多樣性。經(jīng)MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，共得到748 172條raw＿reads序列(每個(gè)樣品平均49 878條)；經(jīng)去除序列兩端的低質(zhì)量區(qū)域、其中的接頭序列、含有模糊堿基N的序列程序處理后，對(duì)序列進(jìn)行組裝拼接，得到744 200條clean-reads序列(每個(gè)樣品平均為49 613條)，優(yōu)質(zhì)序列比率為99.47%，去除clean-reads序列中引物錯(cuò)配過多的序列(≥4 bp),去除引物序列以及嵌合體后，15個(gè)樣品共獲得341 727條優(yōu)化序列，每個(gè)樣品平均22 782條，其中最多為31 305條，最少為14 195條，序列平均長(zhǎng)度456 bp。

樣品稀釋曲線是采取隨機(jī)抽樣的方法獲取數(shù)據(jù)，抽到的序列數(shù)與其所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建的曲線。當(dāng)樣品稀釋曲線趨于平緩時(shí)，說明測(cè)序數(shù)量合理，更多的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的OTU的邊際效應(yīng)很??；反之，說明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。本試驗(yàn)15個(gè)樣品稀釋曲線(圖1-A)表明并非所有樣品都進(jìn)入了平臺(tái)期(即隨著抽取數(shù)據(jù)的增加仍可能檢測(cè)到新的OTU)，但所有樣品的覆蓋度曲線(圖1-B)都已達(dá)到飽和狀態(tài)，表明本研究樣品的測(cè)序量及測(cè)序深度合理，更深的測(cè)序?qū)α鑫敢褐袡z出新的OTU貢獻(xiàn)很小。

A：稀釋曲線；B：覆蓋度曲線。

A: rarefaction curve; B: coverage curve.

圖1樣品稀釋曲線和覆蓋度曲線

Fig.1 Rarefaction curve and coverage curve of samples

2.2 分類學(xué)分析

從圖2-A可以看出，厚壁菌門(Firmicutes)的相對(duì)豐度隨著時(shí)間變化呈先上升后下降的趨勢(shì)。然而，擬桿菌門、纖維桿菌門(Fibrobactere)的相對(duì)豐度總體上呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。螺旋體門(Spirochaetae)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)和浮霉菌門(Planctomycetes)的相對(duì)豐度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。柔膜菌門(Tenericutes)的相對(duì)豐度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

由表3可知，經(jīng)過48 h的發(fā)酵，纖維桿菌門的相對(duì)豐度顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為0.22%；擬桿菌門的相對(duì)豐度也顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為30.69%；黏膠球形菌門在24 h時(shí)顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為3.41%。浮霉菌門的相對(duì)豐度在6、12、24 h時(shí)顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，24 h最低，其相對(duì)豐度為0.59%；厚壁菌門的相對(duì)豐度在6 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為36.69%；變形菌門的相對(duì)豐度在12、24、48 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，24 h最高，其相對(duì)豐度為18.23%；螺旋體門的相對(duì)豐度在48 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為7.05%；柔膜菌門的相對(duì)豐度在48 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為5.58%。

從屬水平細(xì)菌區(qū)系的物種相對(duì)豐度分析，相對(duì)豐度在0.01%以上的屬有72個(gè)，不能歸類到目前已知菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度高達(dá)42.26%。，從圖2-B可以看出，普沃氏菌屬(Pevotella)、鏈球菌屬(Streptococcus)和琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)的比例隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、密螺旋體菌屬(Treponema)呈先下降后上升的趨勢(shì)，絲桿菌屬(Fibrobacter)和解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)呈下降的趨勢(shì)。

由表4可知，隨著時(shí)間的變化，普沃氏菌屬的相對(duì)豐度在12 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為31.19%；鏈球菌屬的相對(duì)豐度在6 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為23.03%；琥珀酸弧菌屬的相對(duì)豐度在12 h時(shí)顯著高于除24 h外的其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為5.94%；RC9_gut_group的相對(duì)豐度在24 h時(shí)顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為1.73%；丁酸弧菌屬的相對(duì)豐度在12 h時(shí)顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為0.26%；密螺旋體菌屬的相對(duì)豐度在12 h時(shí)顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為0.24%；絲桿菌屬的相對(duì)豐度在48 h時(shí)顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度為0.22%；解琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度在24、48 h時(shí)顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，其相對(duì)豐度分別為2.22%和2.42%。

A：門水平；B：屬水平。A: phylum level; B: genus level.

圖2 在體外發(fā)酵條件下瘤胃細(xì)菌組成隨時(shí)間變化分類柱狀圖

續(xù)表3項(xiàng)目Items時(shí)間 Time/h06 12 24 48 SEMP值P-value浮霉菌門 Planctomycetes 1.40a0.70b0.66b0.59b1.14a0.10<0.01柔膜菌門 Tenericutes 0.57d0.57d3.12c4.69b5.58a0.56<0.01TM70.44a0.24b0.23b0.20b0.16b0.030.01迷蹤菌門 Elusimicrobia0.34a0.16b0.16b0.07c0.15b0.02<0.01SR10.28a0.16b0.16b0.11bc0.08c0.02<0.01藍(lán)藻門 Cyanobacteria 0.12a0.12a0.08b0.06b0.07b0.010.02放線菌門 Actinobacteria 0.07b0.15a0.09b0.07b0.06b0.010.02互養(yǎng)菌門 Synergistetes 0.040.010.010.000.020.000.10綠彎菌門 Chloroflexi 0.03a0.01b0.00b0.01b0.01b0.00<0.01

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表4 瘤胃微生物在體外發(fā)酵條件下細(xì)菌組成及其相對(duì)豐度(屬水平)

熱圖是使用漸變的色帶直觀地展現(xiàn)數(shù)據(jù)的疏密程度或頻率高低，可以簡(jiǎn)單地聚合大量數(shù)據(jù)。瘤胃內(nèi)18種門水平的細(xì)菌進(jìn)行雙向聚類分析，結(jié)果顯示(圖3-A)，可從橫向?qū)?5個(gè)樣品分成2個(gè)大簇——擬桿菌門、厚壁菌門，這2個(gè)菌門聚成一類，其余16個(gè)菌門聚成一類(又可聚成2小簇)；從縱向上將15個(gè)樣品分成2個(gè)大簇，左邊的第1大簇包含5個(gè)樣品(0、6 h)，右邊的第2大簇包含10個(gè)樣品(12、24、48 h)。為了進(jìn)一步了解瘤胃微生物細(xì)菌相對(duì)豐度隨時(shí)間的變化規(guī)律，在屬的水平，隨著時(shí)間的變化，瘤胃細(xì)菌組成存在明顯差異(圖3-B)，瘤胃內(nèi)59種菌屬進(jìn)行雙向聚類分析結(jié)

果顯示，可從橫向?qū)?5個(gè)樣品分成3個(gè)大簇，普雷沃氏菌屬聚成一類，鏈球菌屬聚成一類，其他菌屬又聚成一類；從縱向上將15個(gè)樣品分成2個(gè)大簇，左邊的第1大簇包含3個(gè)樣品(6 h)，右邊的第2大簇包含12個(gè)樣品(又可聚成2個(gè)小簇)。

A：門水平；B：屬水平。A: phylum level; B: genus level.

圖3瘤胃微生物在體外發(fā)酵條件下細(xì)菌的雙向聚類分析

Fig.3 Two-way cluster analysis of rumen microbes underinvitrofermentation conditions

2.3 測(cè)序結(jié)果及α多樣性分析

由表5可知，隨時(shí)間變化，Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，但是Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)差異顯著(P<0.05)。各樣本稀釋曲線均達(dá)到平臺(tái)期，說明測(cè)序量及測(cè)序深度合理，各個(gè)樣品的覆蓋率隨著測(cè)序的深度均達(dá)到了平臺(tái)期，覆蓋率都在97%以上，說明測(cè)序數(shù)據(jù)足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)微生物的信息。

2.4 pH和累積產(chǎn)氣量

由表6可知，隨時(shí)間變化，pH在24 h時(shí)顯著

低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。隨時(shí)間變化，累積產(chǎn)氣量逐漸增加，在48 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。

表5 測(cè)序結(jié)果及α多樣性分析

表6 pH和累積產(chǎn)氣量隨時(shí)間的變化

3 討 論

在細(xì)菌群落中，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是瘤胃細(xì)菌的3大優(yōu)勢(shì)菌群[14]，其中擬桿菌門的相對(duì)比例在本試驗(yàn)中是最高的，這與之前給美國(guó)阿拉斯加州和挪威的駝鹿、梅花鹿、水牛以及斯瓦爾巴特群島的馴鹿飼喂冬季飼糧和給大額牛飼喂樹葉和稻草的混合飼糧的研究結(jié)果相一致[15-16]。Qin等[17]和Tun等[18]也證實(shí)無論是人類還是貓科胃腸道菌群中，擬桿菌門和厚壁菌門均占有較高的豐度。Tajima等[19]、Singh等[20]和Peng等[21]都指出荷斯坦牛和水牛瘤胃內(nèi)的細(xì)菌都以擬桿菌門為主，其余菌門的相對(duì)豐度比較少，比如酸桿菌門、藍(lán)藻門等。有研究表明，酸桿菌門、藍(lán)藻門的細(xì)菌更適合在江海湖泊等環(huán)境中生存[22]，它們?cè)诹鑫竾?yán)格厭氧的環(huán)境中無法進(jìn)行生長(zhǎng)與繁殖。擬桿菌門是瘤胃微生物中非纖維性碳水化合物的主要降解者，含有與降解非纖維類多糖有關(guān)的基因[23]，而纖維分解菌在發(fā)酵中后期起主導(dǎo)作用。因此，擬桿菌門的相對(duì)豐度在12 h之后減少。奶牛瘤胃內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生纖維降解酶分解攝入的纖維物質(zhì)，而是依靠體內(nèi)的細(xì)菌、真菌等微生物對(duì)其進(jìn)行降解消化[24]。其中纖維桿菌門消化和分解纖維物質(zhì)起著重要的作用。Liu等[25]的研究表明，纖維桿菌門的纖維桿菌屬?gòu)?～16和48 h的相對(duì)豐度顯著增加，在降解植物纖維性物質(zhì)方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用。而本試驗(yàn)纖維桿菌門在12～48 h降解纖維時(shí)顯著減少，這與發(fā)酵方法不同有關(guān)。本試驗(yàn)是采用的體外發(fā)酵法，隨著時(shí)間的變化，具有分解纖維功能的細(xì)菌之間會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)，纖維素、半纖維素物質(zhì)會(huì)不斷減少，這將會(huì)導(dǎo)致纖維桿菌門相對(duì)豐度顯著減少。而Liu等[25]采用尼龍袋法，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都會(huì)供應(yīng)相同的飼糧，這樣可能會(huì)緩解纖維分解菌之間的競(jìng)爭(zhēng)。同時(shí)在本試驗(yàn)中主要消化纖維的瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬的相對(duì)豐度在12 h之后會(huì)顯著增加，這有可能與纖維桿菌門形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。也有研究結(jié)果表明，鏈球?qū)僦械呐＜S球菌屬(Coccusmucosa)會(huì)造成瘤胃內(nèi)不耐酸細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，比如纖維分解菌，這可能與鏈球菌屬之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[26]。在本試驗(yàn)中，鏈球菌屬的相對(duì)豐度隨著時(shí)間變化顯著增加，而纖維分解菌的相對(duì)豐度顯著減少，這都有可能引起本試驗(yàn)纖維桿菌門隨時(shí)間變化顯著減少。有研究表明，變形菌門的大部分菌屬不僅可以和其他菌屬競(jìng)爭(zhēng)生存，而且在低碳源濃度下也可以適度生長(zhǎng)[27]。隨著長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵，淀粉、蛋白質(zhì)等易降解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本被微生物降解，變形菌門的相對(duì)豐度增加可能與在營(yíng)養(yǎng)濃度低的環(huán)境下與纖維分解菌爭(zhēng)奪資源、適度生長(zhǎng)有關(guān)。有研究表明，厚壁菌門中梭菌綱占很大比例，鏈球菌屬和解琥珀酸菌屬是厚壁菌門的主要優(yōu)勢(shì)菌屬[28]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。厚壁菌門含有大量分解纖維的菌屬[如瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)][29]，這些菌屬的相對(duì)豐度在12 h之后都增加。因此，厚壁菌門的相對(duì)豐度在12 h之后增加。

在屬水平上，大量的研究表明，普雷沃氏菌屬是廣泛存在瘤胃中且數(shù)量最多的一類菌，普雷沃氏菌屬不僅是活性高的蛋白質(zhì)降解菌，而且還能利用淀粉以及果膠。由于遺傳相關(guān)或者高的遺傳變異使得這種菌屬的成員在瘤胃內(nèi)占據(jù)不同的生態(tài)位[30-32]。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致。有研究表明，普雷沃氏菌屬屬于耗氫菌，它可以通過琥珀酸和丙烯酸途徑發(fā)酵糖類物質(zhì)和乳酸,產(chǎn)生丙酸[33-34]，丙酸途徑可能對(duì)瘤胃發(fā)酵是相對(duì)重要的，相應(yīng)地可能會(huì)導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量下降，因?yàn)殓晁?丙酸途徑可以與產(chǎn)甲烷菌爭(zhēng)奪氫。在本試驗(yàn)中，普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度隨時(shí)間變化減少，而甲烷短桿菌的相對(duì)豐度隨時(shí)間增加，普雷沃氏菌屬和產(chǎn)甲烷菌屬的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。普雷沃氏菌屬基本是分解蛋白質(zhì)、淀粉的菌屬。淀粉和蛋白質(zhì)被不斷地代謝分解，被普雷沃氏菌屬所利用，迅速增殖，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷減少，在12 h之后，一些活性高的纖維分解菌屬主要起主導(dǎo)作用。雖然Li等[15]認(rèn)為普雷沃氏菌屬在降解纖維方面發(fā)揮潛在的作用，但它不是主要的纖維素分解菌，普雷沃氏菌屬生長(zhǎng)繁殖可能會(huì)受到其他活性高的纖維分解菌的抑制，這將可能造成普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度隨時(shí)間變化呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。解琥珀酸菌屬是Van Gylswyk于1995年從牛瘤胃中分離，其功能可使琥珀酸轉(zhuǎn)化成丙酸，可能是瘤胃微生物區(qū)系的正常菌[35]，它可以分解淀粉與纖維素。在本試驗(yàn)中解琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度隨時(shí)間變化而減少，這可能與其他淀粉分解菌和纖維素分解菌存在競(jìng)爭(zhēng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能充分地供給自身有關(guān)。琥珀酸弧菌屬最早發(fā)現(xiàn)于牛瘤胃中，其主要發(fā)酵糊精，終產(chǎn)物主要是乙酸和琥珀酸，它具有淀粉分解活性。在本試驗(yàn)中，在12 h之前，琥珀酸弧菌屬的相對(duì)豐度增加，在這個(gè)階段，它們主要發(fā)酵飼糧中的淀粉，在12 h之后，瘤胃中的纖維分解菌起主要作用，所以它們的相對(duì)豐度在這個(gè)階段會(huì)下降。鏈球菌屬中的牛鏈球菌能降解淀粉，但不能降解纖維素，它的作用跟琥珀酸弧菌屬類似，但是它的相對(duì)豐度在6 h之前增加，原因可能是它產(chǎn)生的淀粉分解酶活性會(huì)比琥珀酸弧菌屬?gòu)?qiáng)。密螺旋體菌屬、丁酸弧菌屬、瘤胃球菌屬是瘤胃內(nèi)主要的纖維分解菌，它們的相對(duì)豐度都在12 h之后升高，可能它們?cè)谶@個(gè)階段主要消化纖維性物質(zhì)為主。

α多樣性反映了單個(gè)樣品內(nèi)部物種的多樣性，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Ace指數(shù)。其中Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)反映物種的多樣性。Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品中的物種越豐富。各物種指數(shù)有一定的變化范圍，說明隨著時(shí)間的變化，細(xì)菌組成和多樣性存在差異。Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)無顯著差異，說明隨著時(shí)間的變化，細(xì)菌總數(shù)變化不顯著，但是Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)有顯著差異，說明隨著時(shí)間的變化，細(xì)菌的多樣性存在顯著差異，與0 h相比，Shannon指數(shù)在48 h時(shí)顯著降低，Simpson指數(shù)在48 h時(shí)顯著增加，說明細(xì)菌多樣性顯著降低，可能與發(fā)酵底物消耗以及人工唾液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少有關(guān)。

產(chǎn)氣量是一個(gè)綜合反映飼糧可發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，飼糧中的可發(fā)酵有機(jī)物含量高，微生物的活性就越高，產(chǎn)氣量就越大，反之，微生物的活性較弱，產(chǎn)氣量就較少[36]。本試驗(yàn)中隨著時(shí)間的變化，累計(jì)產(chǎn)氣量顯著增加，微生物都保持較高的活性。pH是影響瘤胃發(fā)酵的重要因素。當(dāng)pH長(zhǎng)時(shí)間過低時(shí)，瘤胃內(nèi)纖維素降解菌降解纖維素的能力下降[37]。pH在6～7 時(shí)可以保證瘤胃正常發(fā)酵。在本試驗(yàn)中，pH在6.26～6.70，均在適宜的范圍。

4 結(jié) 論

奶牛瘤胃體外發(fā)酵過程中，瘤胃細(xì)菌主要的門以及屬的相對(duì)豐度以及多樣性均隨時(shí)間推移發(fā)生改變，且因瘤胃細(xì)菌功能差異在發(fā)酵過程的變化更為顯著。因此，在使用體外發(fā)酵法進(jìn)行研究時(shí)，應(yīng)充分考慮瘤胃細(xì)菌的功能差異與底物以及人工唾液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少引起的發(fā)酵環(huán)境變化的關(guān)系。