李晨晨 朱婷婷 陸 游 羅嘉翔 金 敏 袁 野 周歧存

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院魚類營養(yǎng)研究室，寧波315211)

虎斑烏賊(Sepiapharaonis)隸屬于軟體動物門(Mollusca)，頭足綱(Cephalopoda)，烏賊目(Sepiida)，烏賊科(Sepiidae)，烏賊屬(Sepia)，個體大，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有很高的營養(yǎng)價值，是一種養(yǎng)殖前景明朗的頭足類生物。在自然環(huán)境中，動物常常因為季節(jié)、氣溫、水質(zhì)、食物在空間上的分布不均等原因而面臨饑餓脅迫。在饑餓狀態(tài)下，許多動物會通過減少代謝率以及消耗自身組織的貯存物質(zhì)以應(yīng)對饑餓脅迫[1]。動物通過調(diào)節(jié)身體內(nèi)各種酶的活性來達(dá)到積極利用體內(nèi)儲存物質(zhì)的目的，從而維持生命[2]。在應(yīng)對饑餓脅迫的過程中，氨基酸和脂肪酸的利用順序也有一定的差別。

動物經(jīng)饑餓或者營養(yǎng)不足之后再恢復(fù)正常攝食時，所表現(xiàn)出來的超過正常生長速度的現(xiàn)象稱為補(bǔ)償生長[3]。水生動物補(bǔ)償生長的程度會因為種類、生長階段、饑餓以及恢復(fù)投喂時間的不同而有很大的差異[4-6]。根據(jù)恢復(fù)生長期間試驗動物的特定生長率、體質(zhì)量的變化程度，可將水生動物的補(bǔ)償生長分為4類：超補(bǔ)償生長、完全補(bǔ)償生長、部分補(bǔ)償生長、不能補(bǔ)償生長[7]。研究表明，補(bǔ)償生長可以促進(jìn)水生動物的生長、提高飼料利用率、降低勞動成本[8-10]，減少氮排放量從而降低水體污染[11]。目前國內(nèi)外相關(guān)研究報道主要集中在魚類[12-14]、甲殼類[15]、雙殼類[16]，而關(guān)于頭足類[17]的報道較少。

在研究水生生物補(bǔ)償生長時，采用不同的饑餓和恢復(fù)投喂方式會使得試驗結(jié)果差異較大[18]。循環(huán)饑餓是獲得理想補(bǔ)償生長效果的一種方式[19]，它可以降低飼養(yǎng)人員的勞動強(qiáng)度、節(jié)約人工成本、縮短饑餓時間。樂可鑫等[3]對虎斑烏賊初孵幼體階段的補(bǔ)償生長進(jìn)行了研究，但對虎斑烏賊幼體階段多重周期性饑餓脅迫后的補(bǔ)償生長缺乏深入研究。鑒于此，本試驗以虎斑烏賊幼體為研究對象，擬研究不同周期性饑餓再投喂模式對虎斑烏賊生長性能、肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分、抗氧化指標(biāo)、消化酶活性、氨基酸組成和脂肪酸組成的影響，探討其在饑餓脅迫下的生理響應(yīng)機(jī)制，以期為制訂適合虎斑烏賊幼體的高效投喂策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗用虎斑烏賊幼體為象山來發(fā)水產(chǎn)育苗廠提供，試驗在浙江省寧波市海洋與科技創(chuàng)新基地完成?；邽踬\幼體在試驗前用冰鮮蝦暫養(yǎng)1周，分組前停食24 h，挑選體格健壯、規(guī)格基本一致的個體[初始體重為(6.83±0.01) g]360尾，隨機(jī)分為4組，即1個對照組和3個周期性饑餓再投喂組(S1F6組、S2F5組和S3F4組)，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾，以重復(fù)為單位放養(yǎng)于300 L養(yǎng)殖桶中。每天上、下午各換水1次，每次換水量為50%左右。使用經(jīng)暗沉淀和沙濾后的自然海水，鹽度為21.2‰～26.7‰，溫度為23.8～27.4 ℃，pH為7.5～8.0；采用自然光照，微流水充氣養(yǎng)殖，餌料為小個體的冰鮮蝦(冰鮮蝦體成分以及氨基酸組成和脂肪酸組成見表1)，每天投喂2次，投喂時間分別為07:30與15:30，投喂后1 h內(nèi)觀察其攝食情況。

1.2 試驗設(shè)計

對照組：持續(xù)投喂14 d；S1F6組：饑餓1 d，再投喂6 d，共2個周期；S2F5組：饑餓2 d，再投喂5 d，共2個周期；S3F4組：饑餓3 d，再投喂4 d，共2個周期。試驗期為14 d。

表1冰鮮蝦體成分(濕重基礎(chǔ))、氨基酸(干重基礎(chǔ))和脂肪酸(占總脂肪酸的百分比)組成

Table 1 Body composition (wet weight basis), amino acid composition (dry weight basis) and fatty acid composition (percentage of total fatty acids) of chilled shrimps %

續(xù)表1項目 Items含量 Content氨基酸總量 TAA52.90必需氨基酸總量 TEAA25.59非必需氨基酸總量 TNEAA27.32必需氨基酸總量/氨基酸總量TEAA/TAA0.48脂肪酸 Fatty acid compositionC12∶00.17C14∶011.55C14∶1n0.24C16∶023.14C16∶1n9.84C18∶02.52C18∶1n-918.13C18∶2n-61.92C18∶3n-60.19C18∶3n-30.62C18∶4n-30.93C20∶00.11C20∶1n-91.92C20∶2n-60.06C20∶3n-60.13C20∶4n-60.65C20∶3n-30.06C20∶5n-3 (EPA)15.51C22∶00.20C22∶1n-91.78C22∶5n-60.08C22∶5n-30.41C24∶00.05C22∶6n-3 (DHA)9.76飽和脂肪酸 SFA37.74單不飽和脂肪酸 MUFA31.91多不飽和脂肪酸 PUFA30.32n-3多不飽和脂肪酸n-3 PUFA27.29n-6多不飽和脂肪酸n-6 PUFA3.03n-3/n-69.01DHA/EPA0.63

1.3 樣本采集與分析方法

投喂試驗結(jié)束后，魚停食24 h，取樣前每桶單獨稱重并計數(shù)，計算增重率、特定生長率和存活率；每個養(yǎng)殖桶隨機(jī)取4尾烏賊，分別剝離肌肉用于肌肉常規(guī)成分以及氨基酸與脂肪酸組成的分析，剝離肝臟用于抗氧化指標(biāo)與消化酶活性的測定以及脂肪酸組成的分析。所有操作均在冰上進(jìn)行。

飼料、肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分分析：水分含量測定采用105 ℃常壓干燥法；粗灰分含量的測定采用馬弗爐550 ℃焚燒失重法；粗蛋白質(zhì)含量測定使用蛋白質(zhì)分析儀(LECO FP-528)；粗脂肪含量測定使用脂肪測定儀(SX360)。

氨基酸組成測定：在樣品中加入6 mol/L鹽酸沙浴24 h后，用50 mL容量瓶定容并吸取1 mL溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品加入0.02 mol/L的鹽酸后使用高速氨基酸自動分析儀(L-8900，HITACHI公司，日本)測定氨基酸組成。

脂肪酸組成測定：飼料、肝臟及肌肉樣品經(jīng)過48 h冷凍干燥后，在鹽酸-甲醇溶液和氫氧化鉀-甲醇溶液中抽提脂肪進(jìn)行前處理后，送往中國科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所測定中心，使用氣相-質(zhì)譜儀(GCMS-QP2010 Plus，SHIMADZU公司，日本)測定脂肪酸組成。

抗氧化指標(biāo)測定：先準(zhǔn)確稱取一定重量的待測組織，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件機(jī)械勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存，待測。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性及還原型谷胱甘肽、丙二醛含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒測定，相應(yīng)操作均參照說明書進(jìn)行。

消化酶活性測定：待測組織的前處理與抗氧化指標(biāo)測定時的前處理方法一致。脂肪酶、淀粉酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒測定，相應(yīng)操作均參照說明書進(jìn)行。

1.4 計算公式

增重率(%)=100×(終末均重-初始均重)/初始均重；特定生長率(%/d)=100×(ln終末體重-ln初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù)；存活率(%)=100×(終末尾數(shù)-初始尾數(shù))/初始尾數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當(dāng)組間有差異顯著時，進(jìn)行Tukey’s多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體生長性能的影響

由表2可知，饑餓時間對增重率、特定生長率及存活率均有顯著影響(P<0.05)。S3F4組的增重率、特定生長率及存活率均顯著低于對照組(P<0.05)，而S1F6組和S2F5組與對照組相比則無顯著差異(P>0.05)。

2.2 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，3個周期性饑餓再投喂組虎斑烏賊幼體水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

表2 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響(濕重基礎(chǔ))

2.3 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，不同饑餓時間對肝臟超氧化物歧化酶活性有顯著影響(P<0.05)。隨饑餓時間的延長，肝臟超氧化物歧化酶活性呈先降低后升高再降低的趨勢，在S2F5組達(dá)到最大值。不同饑餓時間對肝臟對丙二醛和還原型谷胱甘肽含量以及谷胱甘肽過氧化物酶活性均無顯著影響(P>0.05)。

表4 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肝臟消化酶活性的影響

由表5可知，不同饑餓時間對肝臟淀粉酶和脂肪酶的活性有顯著影響(P<0.05)。隨著饑餓時間的延長，肝臟淀粉酶活性先下降后升高，在S1F6組有最小值，在S3F4組有最大值，這2組間差異顯著(P<0.05)；肝臟脂肪酶活性則先升高后降低再升高，在S2F5組有最小值，顯著低于其他各組(P<0.05)，在S1F6組有最大值，顯著高于S2F5組和S3F4組(P<0.05)。

表5 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肝臟消化酶活性的影響

2.5 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肌肉氨基酸組成的影響

由表6可知，在虎斑烏賊幼體的肌肉組織中共檢測出17種氨基酸，其中必需氨基酸有10種，非必需氨基酸有7種。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，10種必需氨基酸、7種非必需氨基酸的含量以及氨基酸總量、必需氨基酸總量、必需氨基酸總量/氨基酸總量各組間均差異不顯著(P>0.05)。

表6 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肌肉氨基酸組成的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.6 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肝臟和肌肉脂肪酸組成的影響

由表7可知，在虎斑烏賊幼體肝臟組織中共檢測出24種脂肪酸，起始碳鏈長度在12～24，其中飽和脂肪酸7種，單不飽和脂肪酸5種，多不飽和脂肪酸12種。肝臟單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、n-6多不飽和脂肪酸含量各組間均無顯著差異(P>0.05)。肝臟C22∶5n-3(DPA)、C22∶6n-3(DHA)含量在各組間無顯著差異(P>0.05)，但3個周期性饑餓再投喂組的肝臟C20∶5n-3(EPA)含量與對照組相比均出現(xiàn)了一定程度的降低，其中S1F6組和S2F5組與對照組的差異不顯著(P>0.05)，S3F4組則顯著低于對照組(P<0.05)。3個周期性饑餓再投喂組的肝臟n-3多不飽和脂肪酸含量均較對照組出現(xiàn)了一定程度的降低，其中S3F4組與對照組的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

由表8可知，在虎斑烏賊幼體肌肉組織中共檢測出18種脂肪酸，起始碳鏈長度在12～22，其中飽和脂肪酸4種，單不飽和脂肪酸4種，多不飽和脂肪酸10種。肌肉飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、n-3多不飽和脂肪酸各組間均無顯著差異(P>0.05)，肌肉EPA、DPA、DHA含量各組間也無顯著差異(P>0.05)。3個周期性饑餓再投喂組的肌肉n-6多不飽和脂肪酸含量與對照組均無顯著差異(P>0.05)，但S1F6組顯著高于S2F5組(P<0.05)。

表7 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肝臟脂肪酸的影響(占總脂肪酸的百分比)

續(xù)表7脂肪酸 Fatty acids組別 Groups對照 ControlS1F6S2F5S3F4P值P-value多不飽和脂肪酸 PUFA34.21±0.8226.86±1.5830.77±3.6125.51±1.460.074n-3多不飽和脂肪酸n-3 PUFA30.43±0.93a23.15±1.33ab26.85±3.34ab21.39±1.37b0.048n-6多不飽和脂肪酸n-6 PUFA3.77±0.123.71±0.253.92±0.274.12±0.200.578

表8 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肌肉脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比)

3 討 論

3.1 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體生長性能的影響

饑餓會影響水生動物的行為、存活、生長、代謝等一系列生理變化，饑餓脅迫后恢復(fù)投喂的水生動物會出現(xiàn)不能補(bǔ)償生長、部分補(bǔ)償生長、完全補(bǔ)償生長、超補(bǔ)償生長等響應(yīng)狀態(tài)[20]。Ribeiro等[21]認(rèn)為攝食率和飼料轉(zhuǎn)化率、蛋白質(zhì)合成率及能量儲備是反映試驗動物是否出現(xiàn)補(bǔ)償生長的衡量指標(biāo)。張濤等[22]考慮到曼氏無針烏賊在受到饑餓脅迫時發(fā)生互相殘殺的現(xiàn)象，在研究曼氏無針烏賊的周期性饑餓投喂模式時，將增重率與成活率作為衡量指標(biāo)。阿榮等[23]在研究大菱鲆的補(bǔ)償生長時，將體質(zhì)量變化率以及特定生長率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。在綜合前人試驗的基礎(chǔ)上，本試驗將增重率、特定生長率及存活率作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明，在饑餓與投喂總時間相等的情況下，不同饑餓時間對增重率、存活率、特定生長率均有顯著影響。S1F6組和S2F5組與對照組相比存活率則有下降趨勢，這可能是因為饑餓脅迫因子會影響虎斑烏賊幼體消化酶活性，進(jìn)而影響其存活率，而增重率與特定生長率變化不顯著，表明S1F6組與S2F5組虎斑烏賊幼體出現(xiàn)了補(bǔ)償生長，與阿榮等[23]在大菱鲆幼魚補(bǔ)償生長研究中得到的結(jié)果相似。S3F4組增重率、存活率及特定生長率均顯著低于饑餓時間較短的S1F6組、S2F5組及對照組，表明在饑餓3 d再投喂4 d的模式下，虎斑烏賊幼體不能出現(xiàn)補(bǔ)償生長，說明饑餓時間過長可能不能出現(xiàn)補(bǔ)償生長，不利于虎斑烏賊的產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖。在本試驗中虎斑烏賊幼體各組的存活率均較低，尤其S3F4組，該組的存活率與對照組相比出現(xiàn)了顯著降低，這可能是因為在養(yǎng)殖過程中虎斑烏賊幼體由于饑餓脅迫而出現(xiàn)了自相殘殺的現(xiàn)象。從節(jié)約勞動成本、提高飼料利用率以及減少水體環(huán)境污染的角度來看，虎斑烏賊幼體的最佳投喂模式為周期性饑餓2 d再投喂5 d。

3.2 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

脂肪、糖類以及蛋白質(zhì)是水生動物維持生命活動的主要儲能物質(zhì)，在饑餓期間，水生動物會消耗體內(nèi)的儲能物質(zhì)，從而達(dá)到一種動態(tài)平衡。不同水生動物在饑餓期間對儲能物質(zhì)的利用不同[24]，林小濤等[25]研究發(fā)現(xiàn)南美白對蝦主要利用脂肪作為能量來源，沈文英等[26]研究發(fā)現(xiàn)草魚能較好的利用糖類作為能量來源，Mehner等[27]研究發(fā)現(xiàn)河鱸主要利用蛋白質(zhì)作為能量來源。本試驗結(jié)果顯示，3個周期性饑餓再投喂組虎斑烏賊幼體的肌肉水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量與對照組相比無顯著差異，表明經(jīng)補(bǔ)償生長后，水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪在短期內(nèi)均能恢復(fù)至對照組水平，周期性饑餓再投喂不會影響虎斑烏賊幼體的營養(yǎng)品質(zhì)。

3.3 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

3.4 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊肝臟消化酶活性的影響

在饑餓脅迫條件下，水生動物通過調(diào)節(jié)消化酶活性積極利用體內(nèi)儲能物質(zhì)，從而維持機(jī)體生命[33-35]。目前，有關(guān)于饑餓脅迫引起消化酶活性下降的原因主要是因為食物會通過嗅覺、視覺等影響中樞神經(jīng)對消化腺的分泌支配，而在饑餓脅迫下缺乏這些刺激[36-37]。饑餓會引起消化器官的實質(zhì)性變化，如肝胰腺萎縮等，進(jìn)而降低消化酶的分泌[38]。本試驗結(jié)果表明，虎斑烏賊幼體肝臟中淀粉酶與脂肪酶活性在S2F5組均處于較低水平，這與樂可鑫等[3]所得到的結(jié)果類似。這表明，虎斑烏賊幼體在饑餓初期由于脂肪的匱乏，降低了肝臟脂肪酶的分泌以增強(qiáng)其適應(yīng)性，而在饑餓3 d時，虎斑烏賊幼體對饑餓脅迫已具有一定適應(yīng)性，從而肝臟脂肪酶活性又有一定升高。這與肌肉粗脂肪含量隨著饑餓時間的延長呈先升高后降低的趨勢相吻合。虎斑烏賊為肉食性動物，對碳水化合物的利用率較低，因此其淀粉酶的活性較低。在饑餓初期，由于食物的匱乏，肝臟淀粉酶的活性也隨之降低，而在S3F4組肝臟淀粉酶的活性卻出現(xiàn)升高，這可能是因為肝臟加大了對體內(nèi)肌糖原與肝糖原的利用，以滿足代謝活動的需要。

3.5 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊肌肉氨基酸組成的影響

3.6 周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊肝臟和肌肉脂肪酸組成的影響

在饑餓脅迫下，水生動物對體內(nèi)的不同種類的脂肪酸有著一定的利用順序，首先是飽和脂肪酸，其次是低不飽和脂肪酸，最后是高不飽和脂肪酸[42]。本試驗研究了周期性饑餓再投喂對虎斑烏賊幼體肝臟與肌肉中脂肪酸組成的影響，結(jié)果顯示，3個周期性饑餓再投喂組肝臟和肌肉飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量與對照組無顯著性差異。從3種脂肪酸含量的總變化來看，在虎斑烏賊幼體肌肉組織中，首先被利用的是飽和脂肪酸，隨饑餓時間延長，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸交替被利用。而在虎斑烏賊幼體肝臟中，最先被利用的是多不飽和脂肪酸，隨饑餓時間的延長，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸變交替被利用。這表明在虎斑烏賊幼體不同組織中，不同種類脂肪酸的被利用順序也不盡相同。

EPA與DHA是人體必需的高度不飽和脂肪酸，且哺乳動物自身不能合成。一般海水魚中的EPA與DHA含量要高于淡水魚[43]。EPA、DHA、DPA均屬于n-3多不飽和脂肪酸，是海洋生物里的重要營養(yǎng)成分。EPA在免疫和炎癥反應(yīng)上起著至關(guān)重要的作用，DHA對神經(jīng)功能發(fā)揮重要作用，且為視網(wǎng)膜正常發(fā)育以及發(fā)揮正常功能不可或缺的成分[43]，DPA具有很強(qiáng)的抑制血小板凝集，促進(jìn)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移[44-45]，可用于治療高甘油三酯血癥等[46]。3種周期性饑餓再投喂模式下，虎斑烏賊幼體肌肉中EPA、DHA和DPA的含量與對照組相比均無顯著差異，而在肝臟中，虎斑烏賊幼體的EPA含量在S1F6組和S2F5組與對照組相比差異不顯著，但S3F4組則顯著低于對照組，但是肝臟DHA和DPA含量3個周期性饑餓再投喂組與對照組相比均無顯著差異。這表明，在饑餓1 d再投喂6 d和饑餓2 d再投喂5 d投喂模式下，饑餓脅迫沒有對虎斑烏賊幼體中的重要營養(yǎng)成分產(chǎn)生顯著影響，但在饑餓3 d再投喂4 d投喂模式下，饑餓脅迫會造成虎斑烏賊幼體的營養(yǎng)成分缺失。

4 結(jié) 論

① 綜上所述，S1F6組與S2F5組的虎斑烏賊幼體均出現(xiàn)了補(bǔ)償生長，且肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分沒有發(fā)生顯著變化。

② 從節(jié)約成本、減少污染以及補(bǔ)充生長等方面綜合來看，建議在虎斑烏賊幼體的養(yǎng)殖過程中采用周期性饑餓2 d再投喂5 d的投喂模式。