李曉斌 陳 暉 趙 芳 謝景龍 楊菊青 楊開倫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

孕馬尿中含激素類物質(zhì)、有機(jī)酸、無機(jī)酸、無機(jī)鹽等多種有效成分。激素類物質(zhì)均以結(jié)合的、非結(jié)合的雌激素、孕激素及雄激素形式存在于孕馬尿中[1-3]。研究顯示，孕馬尿中雌激素的含量在70～130 mg/L，而一個(gè)孕期內(nèi)孕馬尿中雌激素含量可達(dá)50～100 g/匹[4]。因此，孕馬尿成為獲取天然雌激素物質(zhì)的主要原料。結(jié)合雌激素是孕馬尿中有效的生物成分之一，是雌激素通過葡糖醛酸化和硫酸鹽化作用形成的激素類物質(zhì)。孕馬尿中的雌激素硫酸鹽是主要以雌酮硫酸鈉(sodium estrone sulfate，Es-S)、馬烯雌酮硫酸鈉(sodium equilin sulfate，Eq-S)、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉(sodium 17α-dihydroequilin sulfate，2H-Eq-S)的形式存在，三者含量之和占激素類物質(zhì)總量的90%以上，是孕馬尿中結(jié)合雌激素的指標(biāo)性成分。研究證明，結(jié)合雌激素在臨床上主要用于激素替代療法(hormone replacement therapy,HRT)，以緩解因雌激素不足引起的臨床癥狀[5]，主要治療和預(yù)防女性絕經(jīng)后出現(xiàn)的更年期綜合征，防治骨質(zhì)疏松癥[6]，預(yù)防老年癡呆癥和冠心病[7]等。目前，關(guān)于孕馬尿中結(jié)合雌激素的相關(guān)研究主要集中在萃取方法、測(cè)定方法以及不同妊娠階段含量的變化方面[8-10]，對(duì)于提高孕馬尿中結(jié)合雌激素含量的研究鮮見報(bào)道。哈薩克馬是新疆主要的馬種，具有乳、肉、役兼用的性能，耐粗飼、耐高寒、適應(yīng)能力強(qiáng)。哈薩克馬是新疆地區(qū)提供孕馬尿原料的主要馬種，提高哈薩克孕馬尿中結(jié)合雌激素的含量可增加牧民的經(jīng)濟(jì)收入。因此，本試驗(yàn)以妊娠中后期的哈薩克孕馬為研究對(duì)象，通過補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素及其組合探究其對(duì)孕馬血漿及尿中3種雌激素硫酸鹽(雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉)含量的影響，為維持哈薩克馬孕期激素正常分泌和提高孕馬尿中結(jié)合雌激素的含量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)時(shí)間：2012年11月至2013年3月；試驗(yàn)地點(diǎn)：新疆伊犁哈薩克自治州新源縣阿勒瑪勒鄉(xiāng)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物選擇

試驗(yàn)以配種日期相近的原則選擇年齡5～7歲、第2～4胎妊娠中期的哈薩克母馬34匹。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將34匹哈薩克孕馬隨機(jī)分為4個(gè)組，分別為對(duì)照組9匹、試驗(yàn)Ⅰ組9匹、試驗(yàn)Ⅱ組8匹、試驗(yàn)Ⅲ組8匹。所有孕馬在相同的飼喂條件下飼養(yǎng)，試驗(yàn)第1～30天，對(duì)照組每匹馬每天補(bǔ)喂50 g玉米粉，試驗(yàn)Ⅰ組每匹馬每天在補(bǔ)喂50 g玉米粉的基礎(chǔ)上再補(bǔ)喂6 g硫酸鈉(購(gòu)自天康生物股份有限公司，分析純)，試驗(yàn)Ⅱ組每匹馬每天在補(bǔ)喂50 g玉米粉的基礎(chǔ)上再補(bǔ)喂5 g微量元素(購(gòu)自天康生物股份有限公司，包括銅、鋅、鐵、錳、硒，含量分別為1.34%、5.38%、6.72%、5.38%、0.014%)，試驗(yàn)Ⅲ組每匹馬每天在補(bǔ)喂50 g玉米粉的基礎(chǔ)上再補(bǔ)喂6 g硫酸鈉和5 g微量元素；試驗(yàn)第31～90天，對(duì)照組每匹馬每天補(bǔ)喂100 g玉米粉，試驗(yàn)Ⅰ組每匹馬每天在補(bǔ)喂100 g玉米粉的基礎(chǔ)上再補(bǔ)喂12 g硫酸鈉，試驗(yàn)Ⅱ組每匹馬每天在補(bǔ)喂100 g玉米粉的基礎(chǔ)上再補(bǔ)喂5 g微量元素，試驗(yàn)Ⅲ組每匹馬每天在補(bǔ)喂100 g玉米粉的基礎(chǔ)上再補(bǔ)喂12 g硫酸鈉和5 g微量元素。整個(gè)試驗(yàn)期為90 d。補(bǔ)喂玉米粉的目的是讓硫酸鈉和微量元素與玉米粉混合，利于馬匹采食硫酸鈉和微量元素。

1.4 飼養(yǎng)管理

所有試驗(yàn)馬匹均采用舍飼，每天分別于飲水時(shí)在運(yùn)動(dòng)場(chǎng)活動(dòng)2 h(12:00—13:00、18:00—19:00)。將馬匹每天的玉米粉、硫酸鈉及微量元素補(bǔ)喂量平均分2等份，分別于09:00和20:00用料盆補(bǔ)喂，確保每匹馬補(bǔ)喂量準(zhǔn)確及采食干凈。試驗(yàn)馬匹飼喂的粗飼料為青干草和苜蓿，飼喂比例為4∶1。每天飼喂5次，分別于09:00、12:00、16:00、20:00和00:00飼喂，確保自由采食。粗飼料營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 粗飼料營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.5 樣品采集及處理

于試驗(yàn)第30天的08:30空腹頸部靜脈采集孕馬血樣。用肝素鈉真空管采集血樣，輕輕搖動(dòng)采血管，然后2 190×g離心15 min，制取血漿，標(biāo)記后于-20 ℃冷凍保存。

1.6 樣品測(cè)定

采用高效液相色譜儀測(cè)定孕馬血漿及尿中的結(jié)合雌激素——雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-二氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量。

1.6.1 色譜條件

1.6.2 流動(dòng)相

緩沖液配制：稱取三水合磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)2.00 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.00 g，轉(zhuǎn)移到1 L容量瓶中，用雙蒸水溶解、定容，混勻，測(cè)定pH(應(yīng)為7.00±0.01，否則用鹽酸或氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié))。

流動(dòng)相為緩沖液∶乙腈(色譜純)∶甲醇(色譜純)=680∶240∶80(V/V/V)，充分混合，0.45 μm濾膜抽濾，超聲波脫氣1 h。

1.6.3 血漿處理及進(jìn)樣量

土墻日光溫室一般南北跨度9～10m、脊高4.2～4.5m、東西長(zhǎng)度60～110m，每座溫室的室內(nèi)面積不小于667m2，個(gè)別土墻日光溫室跨度達(dá)到15m，脊高6.5-7.5m[1]。土墻日光溫室墻體采用就地取土，堆土、機(jī)械碾壓、挖機(jī)削平削齊成墻，墻體頂端厚度1.8-2.3m，基部厚度3.5-5.5m，日光溫室內(nèi)下沉為0.5-1.5m之間，下沉較大的形成半地下式日光溫室，溫室內(nèi)采用單立柱骨架和無立柱骨架。配備保溫被、電動(dòng)卷簾機(jī)、蓄水池等，大部分溫室后墻(或山墻)掏洞入室，配建看護(hù)房，或以門簾替代看護(hù)房。也有相當(dāng)數(shù)量的溫室直接在前棚面，分割棚膜，設(shè)門入室。

將血漿樣充分解凍、混勻，取0.5 mL置于5 mL帶蓋塑料試管中，加入在4 ℃冰箱預(yù)冷的三氯甲烷2 mL，充分混勻，3 500 r/min離心15 min，小心、準(zhǔn)確地吸取上層液(三氯甲烷比重大，在離心管中的下層液)0.3 mL，轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管中，加入等體積的色譜純甲醇0.3 mL，混勻，置于4 ℃冰箱，待測(cè)。上樣前用小型離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，取出后吸取10 μL進(jìn)樣。

1.6.4 尿樣處理及進(jìn)樣量

將孕馬尿樣充分解凍、混勻，取0.2 mL置于1.5 mL Eppendorf管中，加蒸餾水0.8 mL，混勻，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min；取0.4 mL離心上清液到1.5 mL Eppendorf管中，加蒸餾水0.4 mL，混勻；取0.2 mL稀釋后的上清液到1.5 mL Eppendorf管中，加入0.2 mL色譜純甲醇，混勻，吸取10 μL進(jìn)樣。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0軟件中的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素及其組合對(duì)哈薩克孕馬血漿中雌激素硫酸鹽含量的影響

由表2可知，血漿中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉含量各組間均差異不顯著(P>0.05)。但是，補(bǔ)喂硫酸鈉的試驗(yàn)Ⅰ組以及補(bǔ)喂硫酸鈉與微量元組合的試驗(yàn)Ⅲ組血漿中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量均比對(duì)照組高，試驗(yàn)Ⅰ組分別比對(duì)照組提高8.33%、10.00%和8.11%，試驗(yàn)Ⅲ組分別比對(duì)照組提高12.50%、17.50%和8.11%。

表2 補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素及其組合對(duì)哈薩克孕馬血漿中雌激素硫酸鹽含量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素及其組合對(duì)哈薩克孕馬尿中雌激素硫酸鹽含量的影響

由表3可知，隨著孕馬妊娠的進(jìn)行，孕馬尿中3種雌激素硫酸鹽的含量均呈先升高再降低的趨勢(shì)。在試驗(yàn)期內(nèi)的各采樣時(shí)間點(diǎn)，各試驗(yàn)組孕馬尿中3種雌激素硫酸鹽的含量與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)，但各試驗(yàn)組孕馬尿中3種雌激素硫酸鹽的含量在數(shù)值上均高于對(duì)照組。試驗(yàn)第30天時(shí)孕馬尿中3種雌激素硫酸鹽含量最高，此時(shí)試驗(yàn)Ⅲ組孕馬尿中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量達(dá)到155.35、75.48、40.92 μg/mL。

表3 補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素對(duì)哈薩克孕馬尿中雌激素硫酸鹽含量的影響

2.3 補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素及其組合對(duì)哈薩克孕馬尿中雌激素硫酸鹽日排出量的影響

由表4可知，試驗(yàn)期間孕馬日排尿量在3.54～5.34 L，平均為4.33 L，各采樣時(shí)間點(diǎn)各試驗(yàn)組孕馬的日排尿量與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)。3種雌激素硫酸鹽日排出量數(shù)據(jù)顯示，試驗(yàn)第0天，試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量極顯著低于對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.01)。各組孕馬3種雌激素硫酸鹽的日排出量均在試驗(yàn)第30天達(dá)到最高值，此時(shí)試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅲ組雌酮硫酸鈉和馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量

顯著或極顯著高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，同時(shí)試驗(yàn)Ⅲ組17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)第60天，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅲ組3種雌激素硫酸鹽的日排出量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。試驗(yàn)第90天，試驗(yàn)Ⅲ組雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。以上結(jié)果顯示，給孕馬補(bǔ)喂硫酸鈉和微量元素的組合能夠顯著或極顯著提高孕馬尿中雌激素硫酸鹽的日排出量。

3 討 論

機(jī)體合成的結(jié)合雌激素主要有2類：一類是在雌激素C-3上通過葡糖醛酸化作用生成的含有葡糖醛酸基團(tuán)的代謝物；另一類是在雌激素C-3上通過硫酸鹽化作用生成的含有硫酸鹽基團(tuán)的代

謝物。被結(jié)合后的雌激素失去與雌激素受體結(jié)合的能力，以硫酸鹽及葡糖醛酸化物的形式隨尿液排出。研究表明，正常人血漿中雌激素硫酸鹽的含量高于雌激素葡糖醛酸的含量[11]。因此，雌激素硫酸鹽是機(jī)體中起主導(dǎo)作用的結(jié)合雌激素。

表4 補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素及其組合對(duì)哈薩克孕馬尿中雌激素硫酸鹽日排出量的影響

續(xù)表4時(shí)間 Time指標(biāo) Indices對(duì)照組Control group試驗(yàn)Ⅰ組Trial group Ⅰ試驗(yàn)Ⅱ組Trial group Ⅱ試驗(yàn)Ⅲ組Trial group Ⅲ第90天 Day 90日排尿量Urine daily output/(L/d)3.71±0.404.30±1.134.14±0.424.48±0.91雌酮硫酸鈉日排出量Sodium estrone sulfate daily output/(mg/d)426.43±45.53b529.87±140.02ab499.48±50.42ab591.31±120.43a馬烯雌酮硫酸鈉日排出量Sodium equilin sulfate daily output/(mg/d)146.06±15.6Bb229.01±60.52Aa197.94±19.98ABa245.64±50.03Aa17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉日排出量Sodium 17α-dihydroequilin sulfate daily output/(mg/d)99.72±10.65b136.45±36.06a111.26±11.23ab135.21±27.54a

孕馬尿中富含雌激素類物質(zhì)[4]，研究顯示，每升孕馬尿中雌激素類物質(zhì)的含量為70～130 mg，在一個(gè)孕期內(nèi)形成的雌激素類物質(zhì)為50～100 g/匹。孕馬尿中的雌激素類物質(zhì)主要以雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉等結(jié)合態(tài)硫酸鈉鹽形式存在，三者之和占雌激素總量的90%以上。影響孕馬尿中結(jié)合雌激素含量的因素很多，包括年齡、胎次、妊娠階段、飼養(yǎng)管理等[18]，在相同的生理階段，飼養(yǎng)管理可能是影響結(jié)合雌激素合成的主要因素。研究報(bào)道，在硫酸鈉的作用下，給大白鼠和小白鼠補(bǔ)喂對(duì)乙酰氨基酚可以增加它們血液中硫酸鹽和肝臟中PAPS的含量[19-20]。Klaassen等[21]報(bào)道PAPS的含量在正常生理?xiàng)l件下決定了雌激素硫酸鹽的含量，影響PAPS合成最重要的因素是組織中硫酸鹽的含量。因此，提高孕馬尿中結(jié)合雌激素含量的途徑之一可能是增加機(jī)體組織中游離硫酸鹽的含量。

本試驗(yàn)給妊娠中后期的哈薩克馬補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素及其組合，血漿雌激素硫酸鹽含量數(shù)據(jù)顯示，雖然3個(gè)補(bǔ)喂試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著，但是3個(gè)補(bǔ)喂試驗(yàn)組血漿中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量在數(shù)值上均較對(duì)照組提高。孕馬尿中雌激素硫酸鹽含量變化規(guī)律顯示，雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量均在試驗(yàn)第30天(即妊娠第6個(gè)月)時(shí)最高，與姚軍等[22]、木拉塔力·克力木等[23]研究結(jié)果一致，說明孕馬在妊娠中期尿中3種雌激素硫酸鹽的含量最高，隨后降低。姚軍等[22]研究顯示，在妊娠中期孕馬尿中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量分別為(102.3±37.7) μg/mL、(34.8±20.6) μg/mL和(15.8±10.1) μg/mL；木拉塔力·克力木等[23]的結(jié)果顯示，在妊娠中期孕馬尿中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量分別為(124.95±75.00)μg/mL、(53.76±47.97) μg/mL和(24.26±19.50) μg/mL。本試驗(yàn)中，補(bǔ)喂硫酸鈉組和補(bǔ)喂硫酸鈉和微量元素組合組孕馬尿中3種雌激素硫酸鹽的含量明顯高于姚軍等[22]、木拉塔力·克力木等[23]的研究結(jié)果，說明補(bǔ)喂硫酸鈉、微量元素和微量元素組合能夠提高孕馬尿中雌激素硫酸鹽的含量。對(duì)照組孕馬在妊娠中期時(shí)尿中3種雌激素硫酸鹽的含量與木拉塔力·克力木等[23]的研究結(jié)果基本接近，但略高于姚軍等[22]的研究結(jié)果，可能與孕馬的年齡、胎次等有關(guān)。

根據(jù)郭海娟[24]的研究結(jié)果，在妊娠27～29周，奧爾洛夫馬平均每天的排尿量為3.84 L，新吉爾吉斯騎乘型馬為4.08 L，新吉爾吉斯乳用型馬為3.42 L，俄羅斯速步馬為3.67 L，伊犁馬為3.95 L，上述馬種雌酮硫酸鈉的日排出量分別為200.85、213.81、198.96、76.37、140.20 mg/d，馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量分別為171.31、168.50、142.46、27.54、67.05 mg/d，17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量分別為136.03、86.11、57.21、37.21、33.22 mg/d。綜合本試驗(yàn)結(jié)果與上述試驗(yàn)結(jié)果可知，在相同的妊娠階段，不同品種、用途及飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，孕馬尿中雌激素硫酸鹽含量存在較大差異。以本試驗(yàn)34匹孕馬日排尿量為依據(jù)，在妊娠中期，哈薩克馬平均日排尿量為4.84 L。以木拉塔力·克力木等[23]的研究結(jié)果為參照，其研究得出妊娠中期哈薩克馬雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量分別為604.76、260.20、117.42 mg/d，這進(jìn)一步說明相同的品種在相近的妊娠階段孕馬尿中雌激素硫酸鹽的含量接近，而補(bǔ)喂硫酸鈉、硫酸鈉和微量元素的組合能夠提高孕馬尿中雌激素硫酸鹽的含量。

本試驗(yàn)中，補(bǔ)喂硫酸鈉組和補(bǔ)喂硫酸鈉和微量元素組合組孕馬尿中雌激素硫酸鹽的含量要高于對(duì)照組，同時(shí)也高于補(bǔ)喂微量元素組。此結(jié)果說明，相同的品種在同一飼養(yǎng)條件下，補(bǔ)喂硫酸鈉可以提高孕馬尿中雌激素硫酸鹽的含量，而補(bǔ)喂微量元素對(duì)提高孕馬尿中雌激素硫酸鹽的含量無積極作用，但補(bǔ)喂硫酸鈉和微量元素的組合能夠在補(bǔ)喂硫酸鈉的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高孕馬尿中雌激素硫酸鹽的含量。妊娠是一個(gè)復(fù)雜而多變的生理過程，需要各種營(yíng)養(yǎng)物種共同作用來維持母畜妊娠。研究顯示，微量元素除了滿足母畜繁殖的需要外，還有調(diào)節(jié)繁殖激素和維持妊娠的作用[25-26]。補(bǔ)喂微量元素可能增加了雌酮和馬烯雌酮的分泌，而補(bǔ)喂硫酸鈉則增加了PAPS的含量，在硫酸轉(zhuǎn)移酶的作用下形成雌激素硫酸鹽。這可能是補(bǔ)喂硫酸鈉組及補(bǔ)喂硫酸鈉和微量元素組合組孕馬尿中雌激素硫酸鹽含量高于對(duì)照組和微量元素組的原因。

4 結(jié) 論

① 妊娠中期哈薩克母馬尿中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17酮硫雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量隨著妊娠的推進(jìn)先升高后降低。

② 在本試驗(yàn)條件下，給哈薩克孕馬補(bǔ)喂硫酸鈉和微量元素的組合能夠提高孕馬尿中雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17中雌雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的含量，從而顯著或極顯著提高雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉、17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉的日排出量。