周孟能 陳文瓊 陳穎 劉永東

(1.樂山市人民醫(yī)院, 四川 樂山 614000；2.中國科學(xué)院過程工程研究所, 北京 100190)

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計，2015年全球約4.15億糖尿病患者，這一人數(shù)到2040年預(yù)計達(dá)到6.4億[1-4]。隨著糖尿病人的數(shù)量迅速增加，胰島素的市場需求量也在逐年增加。目前，每年胰島素的需求量已經(jīng)超過了16000kg[5]。

1982年，大腸桿菌表達(dá)的重組人胰島素上市[6-7]。根據(jù)不同需要對胰島素分子進(jìn)行改造，可以制備出一系列速效或長效的胰島素類似物。與酵母相比，大腸桿菌具有發(fā)酵方法簡單，蛋白表達(dá)量高，生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點，是優(yōu)先選擇的表達(dá)載體。門冬胰島素是一種速效的胰島素類似物，在糖尿病治療中占有重要地位[8-10]。同其它胰島素類似物一樣，門冬胰島素首先通過大腸桿菌表達(dá)為門冬胰島素原(pro-IAsp)，除含有成熟胰島素分子的A、B鏈外，在A、B中間還含有利于蛋白折疊所需的C肽[11-12]。需利用胰蛋白酶和羧肽酶對門冬胰島素原進(jìn)行酶切[13-15]，去除C肽才能獲得具有生物活性的門冬胰島素分子。優(yōu)化酶切過程及酶切后產(chǎn)物的分離純化對提高門冬胰島素的質(zhì)量和產(chǎn)量均有重要意義。

1 材料與方法

1.1 門冬胰島素原酶切反應(yīng) 門冬胰島素原由本實驗室自行制備，純度大于95%，蛋白濃度調(diào)整為0.3mg/mL，溶于20mMTris-HCl，pH8.5緩沖液。胰蛋白酶配制：取10 mg胰蛋白酶，加入1mL 1m MHCl溶解，濃度為10mg/mL；取10μL，加入990μL 1mMHCl稀釋至0.1mg/mL，分裝到10個0.5mL EP管中，-70℃保存?zhèn)溆?。羧肽酶B配制：取10 mg 羧肽酶B加入1mL 超純水溶解，濃度為10mg/mL；取10 μL，加入990μL超純水稀釋至0.1mg/mL，分裝到10個0.5mL EP管中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取該門冬胰島素原溶液1mL，加入胰蛋白酶和羧肽酶B儲液3μL，混合均勻后，室溫下孵育。反應(yīng)進(jìn)行2 min，10min，30min后分別取150μL反應(yīng)混合物，加入8μL乙酸終止反應(yīng)。反相高效液相分析酶切產(chǎn)物，確定最優(yōu)的酶切條件。

1.2 酶切產(chǎn)物純化 取門冬胰島素原溶液20 ml(0.35mg/mL)，在最優(yōu)酶切條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)終止后，選擇SPFF對酶切后樣品進(jìn)行純化。層析柱尺寸：1×10cm ID，介質(zhì)體積8ml；buffer A：50mMNaAc，pH4.0；buffer B：50mMNaAc，pH4.0，1M NaCl。洗脫條件：0-100%B，15min線性梯度洗脫；流速：1mL/min；檢測波長：280nm。

1.3 RP-HPLC檢測方法[16]選用資生堂Proteonavi柱(4.6mm×250mm,waters2695-2996系統(tǒng)。流動相A：含0.1%TFA的超純水溶液；流動相B：含0.1%TFA的乙腈溶液。20%-50%流動相B/30分鐘；流速：0.5ml/min；采用280nm和214nm雙波長檢測。

1.4 HP-SEC檢測方法 高效凝膠過濾層析(HP-SEC)所用層析系統(tǒng)為AKTA purifer10(GE，美國)。所用凝膠層析柱為superdex peptide30(10×300nm)。上樣量為500μL。Buffer：2M urea、20mMTris-HCl、0.15 M Na2SO4、pH 8-8.5；檢測波長：214 nm、280nm。

1.5 MALDI-TOF檢測方法 通過MALDI-TOF方法檢測酶切純化后產(chǎn)物的分子量。所用儀器為AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀。2μL蛋白樣品與CHCA在金屬板上混合點樣，自然干燥后，MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分子量檢測。

2 結(jié)果

2.1 門冬胰島素原的酶切位點分析 門冬胰島素原的氨基酸從N端開始順序為前導(dǎo)肽(氨基酸1-3)、B鏈(氨基酸4-33)、C肽(氨基酸34-68)以及A鏈(氨基酸69-89)，而成熟胰島素僅含有A鏈和B鏈， AB鏈通過二硫鍵連接形成完整胰島素分子。胰蛋白酶的酶切位點為賴氨酸(K)、精氨酸(R)羧基之后的肽鍵；羧肽酶B作用位點為C端賴氨酸(K)或精氨酸(R)。根據(jù)ExPASyPeptideCutter工具計算，門冬胰島素原經(jīng)胰蛋白酶和羧肽酶同時處理，酶切后可能產(chǎn)生如表所示的肽段?？梢钥闯?，使用兩種酶進(jìn)行酶切時，可以同時除去N端的前導(dǎo)肽以及C肽，獲得完整的胰島素分子,見圖1、表1。

圖1 門冬胰島素原的氨基酸序列Fig 1 The amino acid sequence of proinsulin aspart注：紅色表示C肽序列

Table1Analysisofthepositionsofproinsulinaspartdigestedbycarboxypeptidaseandtrypsin

SiteResykting peptied sequencePosition2MK3R25FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER32FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKB chain34TR35R67EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKC peptide68R89GIVEQCCTSICSLYQLENYCNA chain

2.2 反相高效液相分析監(jiān)測酶切過程 酶切反應(yīng)2min時，214nm與280nm峰型一致，出峰時間相同，主峰在19.5min，但峰形已不再是單峰(見圖2a)。酶切反應(yīng)進(jìn)行10min時(見圖2b)，280nm處吸收峰發(fā)生分裂，吸收主峰位置向后轉(zhuǎn)移至20 min，即門冬胰島素的出峰位置。同時，在洗脫時間17 min左右出現(xiàn)了新的214nm吸收峰，應(yīng)為被切下來的C肽的峰?？梢婋S著反應(yīng)時間延長，主峰出峰時間逐漸向后轉(zhuǎn)移，反應(yīng)30 min后(見圖2c)，主峰已經(jīng)全部轉(zhuǎn)移至20 min處，推測門冬胰島素原已經(jīng)全部轉(zhuǎn)化為門冬胰島素。對酶切產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，可見在酶切10min時(見圖2d)，部分條帶從門冬胰島素原位置轉(zhuǎn)移至門冬胰島素位置，反應(yīng)30 min后，門冬胰島素原幾乎全部轉(zhuǎn)化為門冬胰島素。

2.3 酶切后純化結(jié)果 門冬胰島素原酶切30min后，調(diào)酸至pH4.0終止反應(yīng)，然后采用陽離子層析介質(zhì)SP FF進(jìn)行分離純化，去除C肽。將酶切樣品上樣至SPFF柱，采用0-100% B線性梯度洗脫，在280nm有一個洗脫峰(見圖3)。收集洗脫峰P，采用高效凝膠過濾柱Superdex Peptide30檢測.酶切后純化樣品為單一洗脫峰，表明經(jīng)過SPFF純化后，酶切副產(chǎn)物C肽已經(jīng)被除去，所獲得純化產(chǎn)物的純度大于95%(見圖4a)。MALDITOF檢測酶切純化產(chǎn)物的分子量為5826Da，而門冬胰島素理論分子量為5825.6Da，兩者幾乎完全一致(見圖4b)。該結(jié)果進(jìn)一步證實，SPFF純化洗脫峰為門冬胰島素純品。分析洗脫峰蛋白濃度，計算純化過程目標(biāo)蛋白收率約為30%。

圖2反相高效液相及SDS-PAGE監(jiān)測酶切過程

Figure2RP-HPLCandSDS-PAGEanalysisofenzymedigestionat2min,10min,30min.Lane1:standardofinsulinaspart,lane2,3and4:proinsulinaspartdigestedfor2,10and30min,respectively

注：a、b、c分別為酶切2、10、30min 的反相高效液相圖;d.SDS-PAGE電泳結(jié)果

3 討論

人胰島素分子進(jìn)入體內(nèi)后，會形成二聚和六聚體，但起效時間較慢，不利于血糖控制。研究表明，B鏈靠近C-末端的數(shù)個氨基酸，尤其是B28、B29位的氨基酸與胰島素分子間的聚集關(guān)系密切[17]。因此，通過其氨基酸殘基而改變胰島素的藥代性質(zhì)。長效胰島素如甘精胰島素，分子聚合能力增強(qiáng)，同時由于等電點變化導(dǎo)致在注射部位沉積，實現(xiàn)胰島素長時間平穩(wěn)釋放，維持血液中的基礎(chǔ)胰島素濃度[18]；而速效胰島素的分子性質(zhì)正好相反，分子間聚合能力降低，起效快，代謝周期短，用以替代體內(nèi)餐食胰島素分泌，應(yīng)對進(jìn)食后血糖快速升高的情形[19-20]。門冬胰島素是一種速效胰島素，是在人胰島素分子基礎(chǔ)上將 B28脯氨酸(P)改為門冬氨酸(D)而成。由于引進(jìn)陰離子門冬氨酸，電荷排斥作用增強(qiáng)，能阻止胰島素單體或二聚體的自我聚合，達(dá)到迅速起效的降糖作用。目前國內(nèi)僅有諾和諾德的門冬胰島素在市場銷售，價格昂貴。因此，急需發(fā)展門冬胰島素的制備工藝，開發(fā)國內(nèi)的門冬胰島素品種。

圖3門冬胰島素原酶切后SPFF純化
Figure3PurificationprofileofdigestedproinsulinaspartbySPFF

圖4 高效凝膠過濾及質(zhì)譜檢測純化產(chǎn)物Figure 4 SEC (a) and Mass analysis (b) of purified product注：a.高效凝膠過濾及質(zhì)譜;b.檢測純化產(chǎn)物

人胰島素和門冬胰島素等類似物均由A、B兩條肽鏈通過兩對二硫鍵連接形成。早期胰島素及類似物的生產(chǎn)通過分別制備A、B肽鏈，然后氧化連接形成胰島素分子。但這種方法的制備效率很低。胰島素在人體內(nèi)首先合成的是含信號肽和C肽的前胰島素原，隨后在胰島B細(xì)胞的作用下降解形成胰島素分子。受此啟發(fā)，近年來利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)胰島素也是表達(dá)含C肽的完整胰島素原分子，隨后通過酶切來獲得正確結(jié)構(gòu)恢復(fù)胰島素活性[21]。A、B鏈中間的C肽能促進(jìn)胰島素原在體內(nèi)及體外的正確折疊，將A、B鏈表達(dá)在同一肽鏈能極大提高制備效率[22]。另外，為避免大腸桿菌表達(dá)重組蛋白時N端出現(xiàn)多余的甲硫氨酸，可在胰島素原的N端引入胰蛋白酶的酶切位點(MKR)，多余的甲硫氨酸在酶切過程中可隨C肽同時去除。

雖然C肽能增加胰島素原蛋白表達(dá)，輔助其正確折疊，但胰島素原無降糖活性，必須通過酶切去除C肽，因此酶切過程對最終產(chǎn)品的活性及質(zhì)量至關(guān)重要。門冬胰島素原分子中含多個胰蛋白酶和羧肽酶B的酶切位點，如25位精氨酸(R)位點被切開后會導(dǎo)致B鏈被切為兩截。不同位點鄰近氨基酸序列以及空間結(jié)構(gòu)不同，因此酶切反應(yīng)的難易程度也不完全相同。因此，酶切過程中需要嚴(yán)格控制反應(yīng)時間，避免產(chǎn)生多余的酶切片段。酶切過程中，酶與底物的比例、作用時間、酶活等都對產(chǎn)物生成有重要影響，作用時間太長會導(dǎo)致B鏈被切割成兩部分，時間太短會導(dǎo)致B鏈C端含多余的精氨酸，這些酶切產(chǎn)物不僅會降低最終產(chǎn)品比活，同時也給后續(xù)的分離純化帶來極大難度。門冬胰島素原含酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)，它們所具有的芳香族氨基酸使得門冬胰島素原在280nm處有紫外吸收，而酶切之后形成C肽不含有上述芳香族氨基酸，酶切之后新生成的C肽在280nm沒有吸收，可通過214nm的波長進(jìn)行監(jiān)測。酶切后的門冬胰島素(包含A、B兩條肽鏈)則在兩種波長下均有吸收，因此，反相高效液相分析同時采用兩種波長監(jiān)測酶切產(chǎn)物可清楚反應(yīng)酶切進(jìn)行程度。對門冬胰島素原，胰蛋白酶和羧肽酶B采用質(zhì)量比1：1000時，30min即可酶切完全，同時沒有發(fā)現(xiàn)B鏈被切割的現(xiàn)象。離子交換層析具有分離效果好處理量大的優(yōu)點，并且易于放大。酶切產(chǎn)物經(jīng)一步陽離子交換層析門冬胰島素純度提高至95%，并且收率為30%以上。純化的門冬胰島素分子量與理論值完全一致，再次證明了所采用的酶切條件沒有產(chǎn)生不完整或含多余氨基酸的肽鏈。本論文研究結(jié)果對門冬胰島素的規(guī)模制備奠定基礎(chǔ)，同時對其它胰島素類似物的生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

門冬胰島素可通過酶切大腸桿菌表達(dá)的含多余C肽的門冬胰島素原獲得。這種策略制備過程簡單，生產(chǎn)周期短，能降低藥物價格。門冬胰島素原的酶切工藝，獲得了完整的門冬胰島素分子結(jié)構(gòu)，并通過一步離子交換層析獲得純度95%以上的具有正確結(jié)構(gòu)的門冬胰島素。門冬胰島素原的酶切及分離純化工藝可用于指導(dǎo)門冬胰島素的規(guī)模制備。