謝鑫 陳磊 張立德 苗嘉芮 劉文俊 陳靖 吳成舉

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT)家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6組成。其中STAT1是細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等表達(dá)信號(hào)通路中最重要的影響因子之一[1-3]。各類細(xì)胞因子可以促使STAT1絲氨酸位點(diǎn)磷酸化和酪氨酸磷酸化，磷酸化STAT1進(jìn)入細(xì)胞核后，形成異二聚體或同源二聚體，激活其下游基因表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[4-5]。

自發(fā)性高血壓患者癥狀主要以頭痛和頭暈為主，同時(shí)伴有耳鳴、心悸等。古代中醫(yī)學(xué)是根據(jù)高血壓疾病的臨床癥狀來(lái)辨證論治的。自發(fā)性高血壓疾病屬于中醫(yī)學(xué)的“眩暈、頭痛”等范疇。在《素問(wèn) 至真要大論》中記載：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”；《素問(wèn) 標(biāo)本病專論》“肝病，頭目眩，脅支滿”，指出眩暈與肝臟關(guān)系密切，認(rèn)為自發(fā)性高血壓是由于肝陽(yáng)上亢引起的。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯具有“鎮(zhèn)肝息風(fēng)，滋陰潛陽(yáng)”的作用，其治療肝陽(yáng)上亢型自發(fā)性高血壓具有良好的療效[6]。本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats, SHR)為研究對(duì)象，觀察鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)腹主動(dòng)脈STAT1蛋白表達(dá)和STAT1 mRNA的表達(dá)，從而來(lái)探討鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)肝陽(yáng)上亢型自發(fā)高血壓大鼠降壓的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取24周齡雄性清潔級(jí)SHR大鼠(是基因改良交配自發(fā)高血壓的世界公認(rèn)的高血壓大鼠，其特點(diǎn)：高血壓遺傳穩(wěn)定、易怒、易驚覺(jué)等) 60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成 5 組：模型組(0. 9% 氯化鈉溶液)、中藥小劑量組(鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 18g·kg-1)、中藥中劑量組(鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 40 g · kg-1 )、中藥大劑量組(鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 80 g·kg-1)、復(fù)方羅布麻組(復(fù)方羅布麻混懸液，80g·kg-1), 每組各12 只。選取雄性魏-凱二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)12只設(shè)為正常對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液)。體質(zhì)量(200±10)g，SPF 級(jí)別，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物室溫度 21～26 ℃，相對(duì)濕度46%～56%。

1.1.2 藥物與試劑 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯：生龍骨15g(先煎)、生代赭石30g(先煎)、生牡蠣15g(先煎)、炙龜板15g(先煎)、黃芩15g、梔子15g、甘草5g、牛膝30g、丹參20g、川芎15g、生地15g、白術(shù)10g、鉤藤15g、白芍20g、玄參15g、茯苓10g等，采購(gòu)遼寧中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院藥店(中藥藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院張林老師鑒定，均為合格正品)；藥材常規(guī)煎煮水提，加水1400 mL (8倍量)，浸泡 30 min，其中生代赭石、生龍骨、生牡蠣、炙龜板先煎 30 min，再加入藥方中其余中藥藥材，煎煮 30 min，煎好后用 10 層紗布過(guò)濾，收集藥液。復(fù)發(fā)羅布麻混懸液(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：14022937)。一抗兔抗大鼠STAT1抗體(Abcam Company)；二抗羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(Horse Reddish Peroxidase, HRP)；STAT1引物：上游5'-GAAGCGAAGACAGCAGA -3'，下游 5'-TGGAAGAGGACGAAGG T-3'，GAPDH引物：5'-TCGGACGCCTGGTTAC-3'，5'-TTCCCATTCTCAGCCTTG-3'， RT-PCR試劑盒和實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)于TaKaRa(RR014A)；PCR擴(kuò)增儀(9700 ABI)，核糖核酸提取試劑盒(Triozol Reagent，Invitrogen Life technologies)。

1.2 方法

1.2.1 藥物劑量 按人與大鼠體表面積比換算給藥等效劑量(見(jiàn)陳奇主編 《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法》，人民衛(wèi)生出版社，1994)： 大鼠的劑量=X mg/kg×70kg×0.018/200g = X mg/kg × 70kg × 0.018/0.2 kg=6.3 X mg/kg =(172/60)×6.3=18.06 g/kg ，中藥低劑量：18 g/kg，中藥中劑量：40g/kg，中藥高劑量：80 g/kg，濃度分別是1g/ml，2 g/ml，4 g/ml，復(fù)方羅布麻片80g/kg，濃度是0.02g/ml，灌胃體積是4 ml/d，早晚各一次灌胃，連續(xù)給藥45天。

1.2.2 Western Blot 測(cè)定 取大鼠主動(dòng)脈弓下段的腹主動(dòng)脈1～2 cm，PBS沖洗后，每個(gè)樣本加入總蛋白裂解液，在冰塊中操作勻漿，酚試劑法以牛血清蛋白進(jìn)行蛋白定量，用722分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為650nm的條件下測(cè)得OD值，配成同體積同濃度后，加入Running Buffer 100℃沸水中煮5分鐘，使蛋白變性煮沸，加樣進(jìn)行分離膠和濃縮膠板中跑膠，取膠放入轉(zhuǎn)印槽中進(jìn)行轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，取出轉(zhuǎn)印膜，5%脫脂奶粉封閉2h，TTBS清洗2次，加入一抗(1：1000稀釋)，加入二抗(1：350稀釋)，取出膜，放入平皿中，TTBS沖洗2次，每次5分鐘，ECL發(fā)光(按說(shuō)明書(shū)操作)。

1.2.3 Real Time RT-PCR 測(cè)定 每個(gè)標(biāo)本加入TRIzol法抽提總RNA，在冰浴中迅速勻漿，加入氯仿，12000×g 4℃離心15分鐘，吸取上清液，加入異丙醇搖勻，12000×g 4℃離心15分鐘，棄上清，加75%乙醇1ml，7500×g 4℃離心，棄上清，加Nuclease free water。采用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定260nm、280nm OD值，配成同體積同濃度后，加入RT-PCR試劑盒中的試劑(按說(shuō)明書(shū)操作)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入Real-time PCR試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增(按說(shuō)明書(shū)操作)。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot 結(jié)果 各組STAT1 蛋白印記、內(nèi)參GAPDH蛋白印記表達(dá)，中藥中劑量組和高劑量組、模型組比較表達(dá)降低(見(jiàn)圖1)；正常組、中藥中劑量組和中藥高劑量組、模型組比較，STAT1蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01) ，見(jiàn)圖2。

圖1 STAT1 和GAPDH 蛋白表達(dá)Figure 1 STAT1 and GAPDH protein expression

圖2 STAT1/GAPDH 灰度值比較Figure 2 STAT1/GAPDH gray value

注：N.對(duì)照組；M.模型組;Z1.中藥低劑量組;Z2.中藥中劑量組;Z3.中藥高劑量組;L.復(fù)方羅布麻組。與模型組比較，①P<0.01

2.2 Real Time RT-PCR 結(jié)果 各組腹主動(dòng)脈血管組織中STAT1和內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增曲線顯示各組STAT1和內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增效率一致(見(jiàn)圖3、圖4)；各組腹主動(dòng)脈血管組織中STAT1和內(nèi)參GAPDH溶解曲線：顯示各組STAT1和內(nèi)參GAPDH溶解效率一致，見(jiàn)圖5、圖6；正常組、中藥中劑量組和中藥高劑與模型組比較，STAT1 mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=833.093, sig=0.000,P<0. 01)，見(jiàn)圖7。

圖3 腹主動(dòng)脈血管組織中STAT1擴(kuò)增曲線

Figure3STAT1amplificationcurveinthevasculartissueofabdominalaorta

圖4 內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增曲線Figure 4 GAPDH amplification curve of reference

圖5 腹主動(dòng)脈血管組織中STAT1溶解曲線

Figure5dissolvingcurveofSTAT1invasculartissueofabdominalaorta

圖6 內(nèi)參GAPDH溶解曲線Figure 6 reference GAPDH solubility curve

圖7 STAT1/GAPDH mRAN 擴(kuò)增比值Figure 7 STAT1/GAPDH mRAN amplification ratio

注：N.對(duì)照組;M.模型組;Z1.中藥低劑量組;Z2.中藥中劑量組;Z3.中藥高劑量組;L.復(fù)方羅布麻組。與模型組比較，STAT1 mRNA表達(dá)明顯降低，①P<0.01

3 討論

高血壓疾病分為自發(fā)性高血壓(原發(fā)性高血壓)和繼發(fā)性高血壓疾病，其中90%以上為是自發(fā)性高血壓疾病，病因尚未明確，臨床表現(xiàn)為血壓升高為主的獨(dú)立疾病。自發(fā)性高血壓疾病發(fā)生時(shí)機(jī)體動(dòng)脈系統(tǒng)均受到影響，例如使冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、主動(dòng)脈、股動(dòng)脈等發(fā)生粥樣硬化和纖維化，內(nèi)膜層和中膜層改變，引起管腔狹窄，影響血液流動(dòng)，導(dǎo)致組織細(xì)胞缺血、缺氧死亡。發(fā)生機(jī)理有：①血管內(nèi)膜纖維性增生：血管內(nèi)膜明顯增厚，原始纖維母細(xì)胞散在，發(fā)生血腫，使動(dòng)脈狹窄部分變形。②肌肉纖維增生：血管壁中層、平滑肌和纖維組織增生，動(dòng)脈壁呈同心性增厚，纖維彈力消失引起壁間血腫，在血腫病灶周?chē)嬗写罅磕z原形成。③血管壁中層纖維增生：纖維組織增生、內(nèi)彈力膜損壞、肌纖維被膠原代替。④促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡等作用[7-9]。機(jī)體血管在受到長(zhǎng)期的血壓升高刺激時(shí)，會(huì)造成動(dòng)脈痙攣，血管內(nèi)壓持續(xù)升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞初期通過(guò)細(xì)胞骨架來(lái)適應(yīng)調(diào)節(jié)，然而最終不能承受血壓持續(xù)升高和長(zhǎng)期的作用，使血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞間隙增大，血漿蛋白物質(zhì)滲入血管壁間隙，造成局部血管壁中膜層發(fā)生壞死并釋出溶酶體酶，引起局部蛋白溶解，增加血管壁通透性。血漿蛋白的滲入和未壞死血管中膜層產(chǎn)生蛋白多糖、修復(fù)性膠原纖維。動(dòng)脈管壁隨著長(zhǎng)期的血壓升高刺激，會(huì)出現(xiàn)增厚、失去彈力、管腔狹窄等病理改變[10]。

STAT1是STATs家族中重要的成員之一，活化后的STAT1由兩種結(jié)構(gòu)，分子量為：91 kDa STAT1α和84 kDa STAT1β[11-14]。STAT1α 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中包含Y701磷酸化位點(diǎn)和S727磷酸化位點(diǎn)，STAT1β相對(duì)STAT1α而言，結(jié)構(gòu)較短，只含有Y701磷酸化位點(diǎn)，從而失去轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)[11-13]。STAT1α和STAT1β都含有SH2結(jié)構(gòu)區(qū)、N端結(jié)構(gòu)區(qū)和DBD(DNA結(jié)合區(qū))。通過(guò)STAT1的SH2結(jié)構(gòu)區(qū)和Y701磷酸化位點(diǎn)磷酸化后，形成同源二聚體，從而產(chǎn)生生物學(xué)作用。大量實(shí)驗(yàn)研究表明STAT1具有促進(jìn)凋亡和增殖等作用[15-19]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯能夠抑制STAT1蛋白和STAT1 mRNA的表達(dá)，從而減少腹主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖，降低腹主動(dòng)脈血管重構(gòu)。

中醫(yī)認(rèn)為自發(fā)性高血壓其病因病機(jī)是由于“陰虛陽(yáng)亢，肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，肝陽(yáng)上亢”所致。在《素問(wèn) 五臟生成論》中記載高血壓疾病是“頭痛巔疾，下虛上實(shí)”；《素問(wèn) 至真要大論》中記載：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”；防治自發(fā)性高血壓疾病的主要方法是：“鎮(zhèn)肝熄風(fēng)，滋陰潛陽(yáng)”；鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯是治療“肝陽(yáng)上亢”型自發(fā)性高血壓疾病主要代表方劑，具有降其上行之血、滋養(yǎng)肝腎；潛陽(yáng)降逆、柔潤(rùn)熄風(fēng)、柔肝熄風(fēng)、清泄肝陽(yáng)和疏暢肝氣。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯在臨床治療“肝陽(yáng)上亢”型自發(fā)性高血壓有良好的療效。

4 結(jié)論

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯能抑制自發(fā)性高血壓大鼠腹主動(dòng)脈血管組織中STAT1蛋白表達(dá)和 STAT1 mRNA 表達(dá)，從而抑制腹主動(dòng)脈血管細(xì)胞凋亡和減少血管細(xì)胞增殖的作用，來(lái)降低血管重構(gòu)，起到降低血壓的作用。