謝鑫 陳磊 張立德 苗嘉芮 劉文俊 陳靖 吳成舉

(1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學杏林學院，遼寧 沈陽 110032)

信號轉導與轉錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT)家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6組成。其中STAT1是細胞分化、細胞凋亡、細胞增殖等表達信號通路中最重要的影響因子之一[1-3]。各類細胞因子可以促使STAT1絲氨酸位點磷酸化和酪氨酸磷酸化，磷酸化STAT1進入細胞核后，形成異二聚體或同源二聚體，激活其下游基因表達，產生相應的生物學效應[4-5]。

自發(fā)性高血壓患者癥狀主要以頭痛和頭暈為主，同時伴有耳鳴、心悸等。古代中醫(yī)學是根據高血壓疾病的臨床癥狀來辨證論治的。自發(fā)性高血壓疾病屬于中醫(yī)學的“眩暈、頭痛”等范疇。在《素問 至真要大論》中記載：“諸風掉眩，皆屬于肝”；《素問 標本病專論》“肝病，頭目眩，脅支滿”，指出眩暈與肝臟關系密切，認為自發(fā)性高血壓是由于肝陽上亢引起的。鎮(zhèn)肝熄風湯具有“鎮(zhèn)肝息風，滋陰潛陽”的作用，其治療肝陽上亢型自發(fā)性高血壓具有良好的療效[6]。本實驗以自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats, SHR)為研究對象，觀察鎮(zhèn)肝熄風湯對腹主動脈STAT1蛋白表達和STAT1 mRNA的表達，從而來探討鎮(zhèn)肝熄風湯對肝陽上亢型自發(fā)高血壓大鼠降壓的生物學機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 選取24周齡雄性清潔級SHR大鼠(是基因改良交配自發(fā)高血壓的世界公認的高血壓大鼠，其特點：高血壓遺傳穩(wěn)定、易怒、易驚覺等) 60只，采用隨機數字表法分成 5 組：模型組(0. 9% 氯化鈉溶液)、中藥小劑量組(鎮(zhèn)肝熄風湯 18g·kg-1)、中藥中劑量組(鎮(zhèn)肝熄風湯 40 g · kg-1 )、中藥大劑量組(鎮(zhèn)肝熄風湯 80 g·kg-1)、復方羅布麻組(復方羅布麻混懸液，80g·kg-1), 每組各12 只。選取雄性魏-凱二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)12只設為正常對照組(0.9%氯化鈉溶液)。體質量(200±10)g，SPF 級別，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)條件：動物室溫度 21～26 ℃，相對濕度46%～56%。

1.1.2 藥物與試劑 鎮(zhèn)肝熄風湯：生龍骨15g(先煎)、生代赭石30g(先煎)、生牡蠣15g(先煎)、炙龜板15g(先煎)、黃芩15g、梔子15g、甘草5g、牛膝30g、丹參20g、川芎15g、生地15g、白術10g、鉤藤15g、白芍20g、玄參15g、茯苓10g等，采購遼寧中醫(yī)大學附屬醫(yī)院藥店(中藥藥材經遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院張林老師鑒定，均為合格正品)；藥材常規(guī)煎煮水提，加水1400 mL (8倍量)，浸泡 30 min，其中生代赭石、生龍骨、生牡蠣、炙龜板先煎 30 min，再加入藥方中其余中藥藥材，煎煮 30 min，煎好后用 10 層紗布過濾，收集藥液。復發(fā)羅布麻混懸液(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字：14022937)。一抗兔抗大鼠STAT1抗體(Abcam Company)；二抗羊抗兔辣根過氧化物酶標記(Horse Reddish Peroxidase, HRP)；STAT1引物：上游5'-GAAGCGAAGACAGCAGA -3'，下游 5'-TGGAAGAGGACGAAGG T-3'，GAPDH引物：5'-TCGGACGCCTGGTTAC-3'，5'-TTCCCATTCTCAGCCTTG-3'， RT-PCR試劑盒和實時定量試劑盒購于TaKaRa(RR014A)；PCR擴增儀(9700 ABI)，核糖核酸提取試劑盒(Triozol Reagent，Invitrogen Life technologies)。

1.2 方法

1.2.1 藥物劑量 按人與大鼠體表面積比換算給藥等效劑量(見陳奇主編 《中藥藥理實驗方法》，人民衛(wèi)生出版社，1994)： 大鼠的劑量=X mg/kg×70kg×0.018/200g = X mg/kg × 70kg × 0.018/0.2 kg=6.3 X mg/kg =(172/60)×6.3=18.06 g/kg ，中藥低劑量：18 g/kg，中藥中劑量：40g/kg，中藥高劑量：80 g/kg，濃度分別是1g/ml，2 g/ml，4 g/ml，復方羅布麻片80g/kg，濃度是0.02g/ml，灌胃體積是4 ml/d，早晚各一次灌胃，連續(xù)給藥45天。

1.2.2 Western Blot 測定 取大鼠主動脈弓下段的腹主動脈1～2 cm，PBS沖洗后，每個樣本加入總蛋白裂解液，在冰塊中操作勻漿，酚試劑法以牛血清蛋白進行蛋白定量，用722分光光度計在波長為650nm的條件下測得OD值，配成同體積同濃度后，加入Running Buffer 100℃沸水中煮5分鐘，使蛋白變性煮沸，加樣進行分離膠和濃縮膠板中跑膠，取膠放入轉印槽中進行轉移到硝酸纖維素膜上，取出轉印膜，5%脫脂奶粉封閉2h，TTBS清洗2次，加入一抗(1：1000稀釋)，加入二抗(1：350稀釋)，取出膜，放入平皿中，TTBS沖洗2次，每次5分鐘，ECL發(fā)光(按說明書操作)。

1.2.3 Real Time RT-PCR 測定 每個標本加入TRIzol法抽提總RNA，在冰浴中迅速勻漿，加入氯仿，12000×g 4℃離心15分鐘，吸取上清液，加入異丙醇搖勻，12000×g 4℃離心15分鐘，棄上清，加75%乙醇1ml，7500×g 4℃離心，棄上清，加Nuclease free water。采用紫外可見光分光光度計測定260nm、280nm OD值，配成同體積同濃度后，加入RT-PCR試劑盒中的試劑(按說明書操作)逆轉錄合成cDNA，加入Real-time PCR試劑進行實時定量PCR 擴增(按說明書操作)。

2 結果

2.1 Western Blot 結果 各組STAT1 蛋白印記、內參GAPDH蛋白印記表達，中藥中劑量組和高劑量組、模型組比較表達降低(見圖1)；正常組、中藥中劑量組和中藥高劑量組、模型組比較，STAT1蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0. 01) ，見圖2。

圖1 STAT1 和GAPDH 蛋白表達Figure 1 STAT1 and GAPDH protein expression

圖2 STAT1/GAPDH 灰度值比較Figure 2 STAT1/GAPDH gray value

注：N.對照組；M.模型組;Z1.中藥低劑量組;Z2.中藥中劑量組;Z3.中藥高劑量組;L.復方羅布麻組。與模型組比較，①P<0.01

2.2 Real Time RT-PCR 結果 各組腹主動脈血管組織中STAT1和內參GAPDH擴增曲線顯示各組STAT1和內參GAPDH擴增效率一致(見圖3、圖4)；各組腹主動脈血管組織中STAT1和內參GAPDH溶解曲線：顯示各組STAT1和內參GAPDH溶解效率一致，見圖5、圖6；正常組、中藥中劑量組和中藥高劑與模型組比較，STAT1 mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=833.093, sig=0.000,P<0. 01)，見圖7。

圖3 腹主動脈血管組織中STAT1擴增曲線

Figure3STAT1amplificationcurveinthevasculartissueofabdominalaorta

圖4 內參GAPDH擴增曲線Figure 4 GAPDH amplification curve of reference

圖5 腹主動脈血管組織中STAT1溶解曲線

Figure5dissolvingcurveofSTAT1invasculartissueofabdominalaorta

圖6 內參GAPDH溶解曲線Figure 6 reference GAPDH solubility curve

圖7 STAT1/GAPDH mRAN 擴增比值Figure 7 STAT1/GAPDH mRAN amplification ratio

注：N.對照組;M.模型組;Z1.中藥低劑量組;Z2.中藥中劑量組;Z3.中藥高劑量組;L.復方羅布麻組。與模型組比較，STAT1 mRNA表達明顯降低，①P<0.01

3 討論

高血壓疾病分為自發(fā)性高血壓(原發(fā)性高血壓)和繼發(fā)性高血壓疾病，其中90%以上為是自發(fā)性高血壓疾病，病因尚未明確，臨床表現(xiàn)為血壓升高為主的獨立疾病。自發(fā)性高血壓疾病發(fā)生時機體動脈系統(tǒng)均受到影響，例如使冠狀動脈、頸動脈、主動脈、股動脈等發(fā)生粥樣硬化和纖維化，內膜層和中膜層改變，引起管腔狹窄，影響血液流動，導致組織細胞缺血、缺氧死亡。發(fā)生機理有：①血管內膜纖維性增生：血管內膜明顯增厚，原始纖維母細胞散在，發(fā)生血腫，使動脈狹窄部分變形。②肌肉纖維增生：血管壁中層、平滑肌和纖維組織增生，動脈壁呈同心性增厚，纖維彈力消失引起壁間血腫，在血腫病灶周圍存有大量膠原形成。③血管壁中層纖維增生：纖維組織增生、內彈力膜損壞、肌纖維被膠原代替。④促進血管平滑肌細胞凋亡等作用[7-9]。機體血管在受到長期的血壓升高刺激時，會造成動脈痙攣，血管內壓持續(xù)升高，血管內皮細胞和平滑肌細胞初期通過細胞骨架來適應調節(jié)，然而最終不能承受血壓持續(xù)升高和長期的作用，使血管內皮細胞和血管平滑肌細胞間隙增大，血漿蛋白物質滲入血管壁間隙，造成局部血管壁中膜層發(fā)生壞死并釋出溶酶體酶，引起局部蛋白溶解，增加血管壁通透性。血漿蛋白的滲入和未壞死血管中膜層產生蛋白多糖、修復性膠原纖維。動脈管壁隨著長期的血壓升高刺激，會出現(xiàn)增厚、失去彈力、管腔狹窄等病理改變[10]。

STAT1是STATs家族中重要的成員之一，活化后的STAT1由兩種結構，分子量為：91 kDa STAT1α和84 kDa STAT1β[11-14]。STAT1α 轉錄激活結構域中包含Y701磷酸化位點和S727磷酸化位點，STAT1β相對STAT1α而言，結構較短，只含有Y701磷酸化位點，從而失去轉錄激活結構[11-13]。STAT1α和STAT1β都含有SH2結構區(qū)、N端結構區(qū)和DBD(DNA結合區(qū))。通過STAT1的SH2結構區(qū)和Y701磷酸化位點磷酸化后，形成同源二聚體，從而產生生物學作用。大量實驗研究表明STAT1具有促進凋亡和增殖等作用[15-19]。本實驗研究顯示，鎮(zhèn)肝熄風湯能夠抑制STAT1蛋白和STAT1 mRNA的表達，從而減少腹主動脈細胞凋亡和細胞增殖，降低腹主動脈血管重構。

中醫(yī)認為自發(fā)性高血壓其病因病機是由于“陰虛陽亢，肝風內動，肝陽上亢”所致。在《素問 五臟生成論》中記載高血壓疾病是“頭痛巔疾，下虛上實”；《素問 至真要大論》中記載：“諸風掉眩，皆屬于肝”；防治自發(fā)性高血壓疾病的主要方法是：“鎮(zhèn)肝熄風，滋陰潛陽”；鎮(zhèn)肝熄風湯是治療“肝陽上亢”型自發(fā)性高血壓疾病主要代表方劑，具有降其上行之血、滋養(yǎng)肝腎；潛陽降逆、柔潤熄風、柔肝熄風、清泄肝陽和疏暢肝氣。鎮(zhèn)肝熄風湯在臨床治療“肝陽上亢”型自發(fā)性高血壓有良好的療效。

4 結論

鎮(zhèn)肝熄風湯能抑制自發(fā)性高血壓大鼠腹主動脈血管組織中STAT1蛋白表達和 STAT1 mRNA 表達，從而抑制腹主動脈血管細胞凋亡和減少血管細胞增殖的作用，來降低血管重構，起到降低血壓的作用。