徐艷 譚維維 胡迅 楊宗澤 樊萍 張姝 席佳蕾 王亞曦

(四川大學(xué)華西醫(yī)院生物樣本庫，四川 成都 610041)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC) 是常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，腫瘤相關(guān)病死率居全球第二位[1]。HCC的發(fā)病率與性別及地域相關(guān)，男性發(fā)病率為女性的2～4倍，在地域中主要分布在亞洲 (75%) ，其中大約50%發(fā)生在中國，中國男性HCC的發(fā)病率約為 40.0 /1000000，女性約為15.3 /1000000[2-3]。

HCC的發(fā)生發(fā)展受環(huán)境與遺傳等多因素影響，多年的研究已發(fā)現(xiàn)一些腫瘤相關(guān)基因在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長及粘附等功能中具有重要的作用，可能會引起廣泛的基因組改變并破壞正常細(xì)胞信號通路功能，最終導(dǎo)致HCC的發(fā)生。其中，癌基因CTNNB1位于3q22.1, 其所編碼的蛋白β-catenin是HCC相關(guān)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，該基因在HCC中的突變率可達(dá)到12.8%～44.4%，突變類型大多為單核苷酸置換和缺失突變，并且集中在其3號外顯子區(qū)域[4]。中國人群中相關(guān)的研究報(bào)導(dǎo)較少，本研究擬對HCC患者的CTNNB1基因3號外顯子突變情況進(jìn)行測序，并通過免疫組化方法檢測突變患者組織中β-catenin蛋白的表達(dá)水平，探討該基因3號外顯子突變與HCC發(fā)生的相關(guān)性。

1 對象與方法

1. 1 對象及材料 隨機(jī)選取四川大學(xué)華西醫(yī)院已行手術(shù)的100例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織及配對的遠(yuǎn)端正常組織樣本200份?；颊呔鶠闈h族，其中男85 例，女15例，年齡18～75歲，所有樣本均為手術(shù)后取樣分裝立即液氮凍存?zhèn)溆?。所有患者均由醫(yī)院病理科明確診斷為HCC。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 天根生化科技(北京)有限公司血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA。NanoDrop 8000分光光度計(jì)測量DNA濃度及純度，A260/A280的比值在1.8～2.0之間時(shí)DNA的純度符合PCR擴(kuò)增要求。

1.2.2 PCR擴(kuò)增CTNNB1基因3號外顯子 引物序列為F1: 5′-CAATGGGTCAT ATCACA GATTCT -3′，R1：5′-CTAAGTATTTGCTATCCTAAATGGT -3′。PCR擴(kuò)增體系包括: DNA模板 (25 ng/ml) 2μl、 KOD-Plus-Neo高保真PCR酶 (1.0U/μl) 0.4μl、上下游引物 (10 μmol/L)各0.5μl、Dntp (2 mmol/L) 2μl、MgSO4(25 mmol/L) 1.2 μl、PCR緩沖液2μl，用pH 8.2雙蒸滅菌水補(bǔ)足總體積20μl。94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10s，55℃退火30s，68℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)后68℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物為466bp片段大小，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測序及序列分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。為保證測序結(jié)果的可靠性，采用正反雙向測序?；驕y序結(jié)果使用Chromas軟件和Gene Tool軟件分析，對腫瘤組織、配套正常對照組織測序結(jié)果及GENEBANK中所查到的基因標(biāo)準(zhǔn)序列同時(shí)進(jìn)行比對分析，判斷有無突變并分析相應(yīng)氨基酸的改變情況。

1.2.4 免疫組化檢測突變患者肝癌組織中 β-catenin蛋白的表達(dá) 根據(jù)測序及序列分析結(jié)果，選取已發(fā)現(xiàn)有CTNNB1基因3號外顯子突變的患者，對其腫瘤及正常對照組織進(jìn)行β-catenin蛋白表達(dá)檢測。所有標(biāo)本制備石蠟切片并采用SP免疫組化法進(jìn)行染色。β-catenin單克隆抗體，SP免疫組化試劑盒和辣根過氧化氫酶二氨基聯(lián)苯胺 (diami-nobenzidine，DAB) 顯色試劑盒購自Dako公司 。主要方法如下：組織經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋并制成4μ m厚的切片、常規(guī)脫蠟和水化后PBS液沖洗3次，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性并 置于pH6.0的枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)；室溫下正常山羊血清阻斷非特異性反應(yīng)，滴加一抗試劑，4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫下孵育，最后DAB顯色、蘇木素復(fù)染、二甲苯透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片在高倍鏡 (×400)下隨機(jī)選擇 10 個(gè)不重復(fù)視野。結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比綜合判定結(jié)果。染色強(qiáng)度為無著色0分，淺黃色1分 ，棕黃色2分 ，棕褐色 3分；陽性細(xì)胞百分比<10%計(jì) 0分 ，10%～40%計(jì) 1分，41%～ 70%計(jì)2分 ，≥71%計(jì) 3分；將上述兩項(xiàng)得分相加，0～1分為蛋白表達(dá)陰性，2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強(qiáng)陽性，其中 2～6分為蛋白表達(dá)陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSSl8.0統(tǒng)計(jì)軟件對CTNNB1基因突變與患者性別、發(fā)病年齡、有無乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 感染及腫瘤分化程度等臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。其中，計(jì)數(shù)資料比較應(yīng)用四格表卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料比較應(yīng)用t檢驗(yàn)或方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CTNNB1基因3號外顯子突變情況 100例腫瘤組織中3例發(fā)生突變，突變率為3%。3例均為雜合錯(cuò)義突變，1例為CTNNB1外顯子區(qū)域第363位堿基出現(xiàn)一個(gè)雜合突變 (c.363 A> T)，引起第32位密碼子編碼的氨基酸由天冬氨酸變?yōu)榱死i氨酸 (p.D32V)，見圖1；另外2例患者均在外顯子區(qū)域第375位堿基檢測出同一種雜合錯(cuò)義突變 (c.375 A> C)，引起第36位密碼子編碼的氨基酸由組氨酸變?yōu)榱烁彼?(p.H36P)，見圖2。這兩種突變均位于既往報(bào)道的3號外顯子突變熱點(diǎn)區(qū)域。

2. 2 β-catenin蛋白在CTNNB1基因3號外顯子突變患者組織中的表達(dá) 對3例檢測到CTNNB1基因3號外顯子突變的HCC患者的腫瘤及配對正常組織進(jìn)行免疫組化檢測，結(jié)果均顯示：β-catenin蛋白在正常肝組織中主要定位于細(xì)胞膜，為弱表達(dá)；腫瘤組織染色主要定位于細(xì)胞膜及胞漿，表達(dá)明顯較正常組織增強(qiáng)，為強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖3。

2.3CTNNB1基因突變與臨床病理特征之間的關(guān)系 將3例CTNNB1突變患者歸為一組，無突變者歸為另一組，對患者的性別、發(fā)病年齡、有無HBV感染及腫瘤分化程度等臨床表型進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖1CTNNB1基因雜合錯(cuò)義突變(c.363A>T，p.D32V)

Figure1Themissensemutations(c.363A>T，p.D32V)ofCTNNB1gene

圖2CTNNB1基因雜合錯(cuò)義突變(c.375A>C，p.H36P)

Figure2Themissensemutations(c.375A>C，p.H36P)ofCTNNB1gene

圖3 HCC患者腫瘤及正常組織中β-catenin蛋白表達(dá)(×400)

Figure3β-cateninexpressionintumorandnormaltissuesofHCCcases(×400)

表1CTNNB1基因突變與臨床病理特征相關(guān)性

Table1TherelationshipbetweenclinicopathologicalcharactersandCTNNB1mutations

臨床參數(shù)CTNNB1突變有無P性別0.460 男382 女015發(fā)病年齡(歲)0.105 <50046 ≧50351HBV感染0.394 有378 無019分化程度0.647 高分化02 中分化375 低分化020

3 討論

大量研究顯示，包括HCC在內(nèi)，不同類型的癌癥中均檢測到了CTNNB1基因突變，并且突變大多發(fā)生在3號外顯子區(qū)域。該基因突變能夠造成其編碼蛋白β-catenin表達(dá)異常，在胞質(zhì)內(nèi)聚集并轉(zhuǎn)位入核導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路異?；罨?，并進(jìn)一步影響到細(xì)胞的生存、增殖、分化及血管生成等各種功能。

目前已發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)與很多癌癥的發(fā)生有關(guān)，如肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌和前列腺癌等[5-8]。本研究在100例HCC患者腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了兩種雜合錯(cuò)義突變，突變率為3%，其中1例突變 (c.363 A> T) 引起密碼子32所編碼的天冬氨酸變?yōu)榱死i氨酸 ( p.D32V)；另外2例患者的同一種突變 (c.375 A> C)，則使密碼子36所編碼的組氨酸變?yōu)榱烁彼?( p.H36P)。這兩種突變均位于既往報(bào)道中的CTNNB1基因3號外顯子突變熱點(diǎn)區(qū)域(密碼子32、33、36、37、41、45等區(qū)域)[9-11]，即正好位于β-catenin蛋白的重點(diǎn)功能區(qū)域氨基端，這一區(qū)域包括糖原合成酶激酶3β (Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β) 和酪蛋白激酶1α (Casein kinase1α，CK1α) 的磷酸化位點(diǎn)，其中，密碼子33、37、41為GSK-3β的磷酸化位點(diǎn)、密碼子45為CK1α的磷酸化位點(diǎn)；而本研究檢測到的兩種突變分別位于密碼子32、36，則屬于鄰近GSK-3β綁定位點(diǎn)的非磷酸化位點(diǎn)，一些研究報(bào)道認(rèn)為該類突變主要是通過氨基酸的結(jié)構(gòu)變化引起蛋白質(zhì)的功能改變，干擾β-catenin與GSK-3β等激酶的正常結(jié)合并致磷酸化異常，正常情況下， β-catenin 的磷酸化是啟動其泛素降解的起始信號，以上突變最終可能導(dǎo)致β-catenin 逃避降解，并在胞內(nèi)水平升高[12-13]。因此，本研究進(jìn)一步檢測這3例HCC患者腫瘤及配對正常組織中的β-catenin蛋白表達(dá)情況，結(jié)果均顯示β-catenin蛋白在正常組織中弱表達(dá)，在腫瘤組織中的表達(dá)則相對明顯增強(qiáng)，提示本研究所檢測到的2種突變很可能直接導(dǎo)致了患者腫瘤組織中β-catenin蛋白的異常高表達(dá)。在生理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控正常肝細(xì)胞的功能，動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，剛出生的小鼠體內(nèi)β-catenin含量會迅速升高并在細(xì)胞核內(nèi)聚集，這種變化與肝細(xì)胞的增殖活躍相一致，在短期內(nèi)可促進(jìn)肝臟的生長；在成年期的肝臟，該基因磷酸化失活，β-catenin蛋白大部分位于細(xì)胞膜上，很少出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[14-15]。針對不同物種的研究又發(fā)現(xiàn)，小鼠、大鼠及人類肝臟再生時(shí)，β-catenin均有顯著的升高，這種升高是由于蛋白降解的減少所致，而非mRNA的高表達(dá)造成，因此，Wnt/β-catenin通路在肝臟的生長和再生修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用[16]，但這種生理性的升高通常在48 h內(nèi)降至正常水平。病理狀況下，胞漿內(nèi)β-catenin水平升高入核形成β-catenin-Tcf/Lef復(fù)合體，通過調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)并與其它信號通路，如核因子-κB(Human nuclear factor-kappa B,NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子β (Transforming growth factor-β，TGF-β) 等通路相互作用而參與HCC的發(fā)生，轉(zhuǎn)移等過程[17-18]。

HBV慢性感染是我國HCC發(fā)生的最主要病原之一，既往針對CTNNB1基因突變與HBV相關(guān)HCC的研究結(jié)果并不一致，部分研究在HBV相關(guān)HCC患者中檢測到較高的CTNNB1基因突變率[20]，而較多的研究則認(rèn)為相對于丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus，HCV) 感染或飲酒相關(guān)的HCC，CTNNB1的基因突變率在HBV相關(guān)HCC中是相對較低的[21-22]。本研究觀察到3例檢測出突變的患者共同的特征都是大于50歲的男性HBV感染患者，但經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，突變與臨床病理特征之間的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與納入研究的樣本量相對較小、同時(shí)在本研究人群中所發(fā)現(xiàn)的突變率較低有關(guān)，還需加大樣本量進(jìn)一步證實(shí)，并考慮該基因其它外顯子突變的可能性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，CTNNB1基因3號外顯子突變存在于HCC患者腫瘤組織中，并導(dǎo)致其編碼蛋白的異常表達(dá)，可能與HCC的發(fā)生相關(guān)。由于納入研究的樣本量較小，需擴(kuò)大樣本量對該基因變異予以進(jìn)一步驗(yàn)證。