曹丹 任艷 羅曉光 魏玲

隨著人口老齡化趨勢到來, 帕金森氏病(PD)這一中老年常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病越受到研究者重視, 其發(fā)病率隨年齡增長而顯著增加, 85歲以上的老人接近50%有輕度PD樣癥狀。其發(fā)病機制可能與年齡老化、環(huán)境因素、氧化應激、線粒體功能障礙、膠質(zhì)細胞增生和炎癥反應等有關, 但線粒體功能障礙早已成為早期病理現(xiàn)象受到研究者們的關注。迄今為止有關PD的治療均為對癥治療, 無法進行根本有效的病因治療。因此, 尋找一種能減少多巴胺(DA)能神經(jīng)元丟失及阻斷或延緩病程發(fā)展的治療方法是目前亟待解決的難題。

1 材料與方法

1.1 材料 MI為原代大鼠的神經(jīng)MI(購于PriCells生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 MI培養(yǎng) MI取對數(shù)生長期細胞用于實驗, 以終濃度100 ng/ml PMA刺激MI 72 h后為共育時所需老化MI。

1.3 PC12傳代培養(yǎng) 復蘇后的PC12細胞并傳代培養(yǎng)(購于中國科學院細胞研究所), 取對數(shù)生長期細胞用于實驗。以低劑量250 nM魚藤酮刺激PC12細胞8 h后, 收集損傷PC12細胞于24孔板上。

1.4 實驗分組 將刺激后的MI及轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)移入有受損的PC12細胞的培養(yǎng)板內(nèi)建立兩種細胞的共育系統(tǒng), 實驗分為3組：A組(空白對照組)： PC12細胞, 未給予任何處理藥物；B組：PC12與老化MI共育；C組：魚藤酮損傷PC12與老化MI共育。共育24 h結(jié)束后移走轉(zhuǎn)移篩板及其上面的細胞,對收集PC12細胞進行膜電位及ROS檢測。

1.5 MI老化相關β-半乳糖苷酶(β-gal)染色 每孔加入300 μl β-gal染色固定液, 室溫固定 15 min；PBS洗滌3次；每孔加入300 μl染色工作液(試劑盒購于上海碧云天)；37℃無CO2溫箱孵育過夜；普通光學顯微鏡下觀察。

1.6 PC12細胞線粒體膜電位檢查 采用JC-1標記法(試劑盒購于碧云天, 上海), 加入500 μl JC-1染色工作液, 37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min, 吸除上清, 用JC-1染色緩沖液洗滌2次, 加入400 μl細胞培養(yǎng), 流式細胞儀檢測分析。

1.7 PC12細胞內(nèi)ROS水平檢測 細胞收集后懸浮于稀釋好的2', 7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(10 μmol/L)中,37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸, 無血清細胞培養(yǎng)液洗滌3次, 流式細胞儀檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 多組資料用One-Way ANOVA方法進行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 老化MI形態(tài)鑒定 β-gal是一種鑒別細胞衰老的生物學標志。細胞內(nèi)產(chǎn)生的藍色沉淀物即表明細胞進入衰老狀態(tài)。實驗結(jié)果顯示, PMA刺激MI藍染陽性細胞數(shù)明顯增加。

2.2 老化MI及魚藤酮干預對PC12細胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位是細胞損傷極為敏感的指標之一, 膜電位的下降可以反映細胞凋亡早期的變化。本研究通過流式細胞儀檢測PC12細胞線粒體膜電位, 用FL1/FL2評價線粒體損傷情況, 比值越高損傷越嚴重。實驗結(jié)果顯示, C組FL1/FL2最高, B組、C組FL1/FL2均高于A組, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。說明C組細胞線粒體膜電位最低, B組、C組細胞線粒體膜電位均低于A組。

表1 三組FL1/FL2比較( ±s, n=3)

表1 三組FL1/FL2比較( ±s, n=3)

注：與A組比較, aP＜0.05

組別 FL1/FL2 A組 1.03±0.16 B組 1.40±0.10a C組 1.57±0.14a

2.3 老化MI及魚藤酮干預對PC12細胞ROS水平的影響 本研究通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)二氯二氫熒光素(DCF)熒光強度, 用平均熒光強度值評價細胞內(nèi)ROS水平。實驗結(jié)果顯示, C組細胞DCF熒光強度最高, B組、C組與A組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。說明C組細胞ROS水平最高, B組、C組細胞ROS水平高于A組。

表2 三組DCF熒光強度比較(±s, n=3)

表2 三組DCF熒光強度比較(±s, n=3)

注：與A組比較, aP＜0.05

組別 DCF熒光強度A組 171.07±17.26 B組 846.97±25.08a C組 982.72±25.1a

3 討論

MI的激活和炎癥反應在PD 神經(jīng)變性病中的作用越來越受到學者的重視［1］。大量病理學證據(jù)均支持MI過度活化是黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元損傷的重要原因, 推測老化MI可分泌各種炎性介質(zhì), 持續(xù)對周圍微環(huán)境施加影響。當腦內(nèi)老化MI大量存在時, 微環(huán)境發(fā)生改變, 遭遇病理刺激后發(fā)生過度炎癥反應, 引發(fā)氧化應激產(chǎn)物的大量釋放, 促進了DA神經(jīng)元的死亡。研究發(fā)現(xiàn), 線粒體損傷及功能改變在細胞凋亡過程中起到重要作用, 線粒體功能下降包括膜電位減低, 氧化磷酸化-電子傳遞偶聯(lián)異常等, 最終導致神經(jīng)細胞凋亡［2］。調(diào)控細胞凋亡的一些因子, 如細胞色素C(Cyt-C)、Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前體等都定位于線粒體內(nèi), 從而破壞線粒體膜的通透性和完整性。

魚藤酮是一種特異性線粒體復雜體Ⅰ抑制劑［3］。通過抑制線粒體復合體Ⅰ, 促進ROS的形成, 產(chǎn)生氧化應激導致線粒體功能障礙, 從而導致DA神經(jīng)元的死亡。本實驗中老化MI同損傷的神經(jīng)細胞進行共育, 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn), 老化MI顯著減低了正常PC12和受損PC12的線粒體膜電位并且提高了ROS分泌水平。提示在本實驗環(huán)境下, 老化MI不利于損傷神經(jīng)細胞的恢復, 具有神經(jīng)毒性作用。

近年來, 越來越多研究證實自由基在PD發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。當線粒體呼吸鏈受到抑制, 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換可誘導ROS生成。當防御機制受到攻擊時, 大量氧自由基積聚造成對膜不飽和脂肪酸的攻擊, 引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,使以丙二醛為主的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多, 進一步引起細胞代謝和功能障礙, 造成細胞損傷［4］。ROS是魚藤酮誘導神經(jīng)細胞死亡的最重要因素之一。魚藤酮誘導PC12細胞ROS水平的增加, 在老化MI刺激下, ROS生成進一步加重, 從而進一步損害線粒體電子傳遞。本研究發(fā)現(xiàn), 在老化微環(huán)境中魚藤酮組PC12可顯著增加ROS水平。

綜上所述, 線粒體損傷與PD的關系非常緊密, 一方面可以為疾病提供早期診斷提供依據(jù), 從亞細胞和分子水平研究其與PD的關系, 另一方面對新藥研發(fā)的設計都有重要的指導意義。