章凡 楊宗元

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科（武漢430030）

卵巢癌惡性程度高，一旦發(fā)現(xiàn)大部分患者處于疾病的中晚期并出現(xiàn)典型的廣泛腹腔轉(zhuǎn)移及大量惡性腹水[1]。腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用越來越被重視。惡性腹水作為卵巢癌患者特異性的腫瘤微環(huán)境，其產(chǎn)生與嚴(yán)重程度與疾病預(yù)后密切相關(guān)[2]；腫瘤微環(huán)境中的主要間質(zhì)細(xì)胞成分是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，其在腫瘤發(fā)生、耐藥、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用[3]。而在腹水微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞以懸浮形式單個(gè)或以球體形式存在，抵抗失巢凋亡壓力進(jìn)而介導(dǎo)腹腔黏附與侵襲過程[4]。腹水中除了大量細(xì)胞因子，化學(xué)因子之外，還包括大量免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及系膜細(xì)胞等。腹腔中的巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)卵巢癌球體腫瘤細(xì)胞生存及腹腔播散侵襲過程[5]。相比而言，惡性腹水中的成纖維細(xì)胞的活性狀態(tài)及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞黏附侵襲的影響鮮有報(bào)道。

瘦素（Leptin）本來作為一個(gè)人體能量代謝相關(guān)的基因，而如今被報(bào)道大量存在于卵巢癌患者惡性腹水中[6]，且其表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后負(fù)相關(guān)[7]。在以往研究中，Leptin被認(rèn)為能夠誘導(dǎo)卵巢腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，維持腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞屬性進(jìn)而促進(jìn)腫瘤侵襲[8-9]。在筆者之前的研究中，Leptin被證明通過調(diào)控Pi3k/AKT/MTOR通路活化促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲播散，中和腹腔中Leptin能夠遏制卵巢癌腹腔播散過程[10]。而Leptin是否通過調(diào)控微環(huán)境其他類型細(xì)胞活化進(jìn)而間接影響卵巢癌腹腔播散尚無研究。本研究旨在探究Leptin對(duì)腹腔微環(huán)境中成纖維細(xì)胞活性作用，及其對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性行為的影響。同時(shí)探索早期靶向腹腔Leptin對(duì)腹腔中活化腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞含量及活性的改變，以及對(duì)卵巢癌腹腔播散結(jié)局的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和OV90購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC），成纖維細(xì)胞系MRC5購自中科院細(xì)胞庫，人系膜細(xì)胞系HMrSV5購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，正常卵巢成纖維細(xì)胞NOF來源于同濟(jì)醫(yī)院腫瘤生物醫(yī)學(xué)中心之前原代培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞用McCoy′s 5A培養(yǎng)基（Thermo Scientific），HMrSV5細(xì)胞及成纖維細(xì)胞用DMEM/F?12培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL，在37℃，5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與材料McCoy′s 5A及DMEM/F?12培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司。重組人Leptin蛋白購于Peprotech公司。IgG及Leptin中和抗體購自R&D公司。α?SMA鼠單抗，PDGFRB兔單抗，F(xiàn)AP兔單抗及GAPDH兔單抗購自美國Ab?cam公司。DAPI，羊抗兔，羊抗鼠熒光二抗購于武漢三鷹公司。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）底物為美國Pierce公司產(chǎn)品。鼠尾膠原，Matrigel購于BD公司。

1.3 流式分選惡性腹水中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞取高級(jí)別漿液性卵巢癌初治患者腹水1 000 mL，在無菌條件下常溫離心1 000 r/min×10 min，棄上清后室溫下裂解紅細(xì)胞5 min，PBS洗凈后離心1 000 r/min×5 min，0.5%胰酶消化5 min后用200目濾網(wǎng)過濾后再標(biāo)記兔抗PDGFRB抗體（1∶50），4℃孵育0.5 h，再用預(yù)冷PBS洗2遍后標(biāo)記FITC標(biāo)記羊抗兔（1∶100），再用預(yù)冷PBS洗2遍后用0.5 mL PBS重懸，用流式分選細(xì)胞儀分離FITC+細(xì)胞。

1.4 免疫熒光流式分選得到的PDGFRB+腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，或MRC5細(xì)胞以及原代NOF細(xì)胞（對(duì)照組及Leptin處理組），用4%多聚甲醛固定10 min，再用預(yù)冷PBS洗2遍，接著用0.1%TritonX?100破膜處理10 min，然后用5%BSA室溫封閉30 min，同時(shí)加鼠抗aSMA抗體（1∶100），37℃孵育2 h。PBS沖洗，同時(shí)加Cy3標(biāo)記羊抗鼠（1∶200），37℃避光孵育1 h。之后均避光操作，PBS沖洗，DAPI工作液染核5 min，PBS沖洗后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 Transwell試驗(yàn)Transwell上室每孔加入60 μL用無血清培養(yǎng)基1∶5稀釋的Matrigel，37℃放置2 h備用。凝固后各組小室上室內(nèi)加入100 μL含2×104SKOV3或OV90細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，下室加入500 μL無血清培養(yǎng)基（對(duì)照組）或無血清培養(yǎng)基加1×104腹水成纖維細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組），至培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。后取出小室，用棉簽拭去膜上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗凈后風(fēng)干。高倍鏡下計(jì)數(shù)穿到膜背面細(xì)胞數(shù)，選5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)。

1.6 系膜細(xì)胞撕開試驗(yàn)CMAC標(biāo)記的系膜細(xì)胞HMrSV5種于六孔板，用無血清培養(yǎng)基加5%BSA，直到細(xì)胞密度達(dá)到100%；計(jì)數(shù)SKOV3或OV90細(xì)胞各105個(gè)加入系膜細(xì)胞培養(yǎng)孔，實(shí)驗(yàn)組加入經(jīng)成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后腫瘤細(xì)胞，48 h后鏡下比較腫瘤細(xì)胞球體撕裂系膜細(xì)胞面積大小。用Image J軟件定量撕裂面積大小。

1.7 ELISA16例惡性腹水來自武漢同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科2017年1-4月診斷為卵巢癌的患者，為卵巢癌初治且未接受化療；同時(shí)取此期間12例卵巢良性病變?nèi)缱訉m內(nèi)膜異位癥或卵巢黏液性囊腺瘤患者腹腔沖洗液作為良性對(duì)照；良惡性腹水獲得后在無菌條件下常溫離心3 000 r/min×10 min，取上清存儲(chǔ)于-80℃冰箱；ELISA操作步驟按照R&D公司提供的操作指南具體操作。

1.8 公共數(shù)據(jù)庫分析腫瘤微環(huán)境中4種主要細(xì)胞成分（腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞）Leptin受體LEPR表達(dá)值從GEO公共數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中的GSE39396獲得，mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)通過GCBI數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https：//www.gcbi.com.cn）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，均一化后進(jìn)行表達(dá)水平比較。

1.9 Western blot試驗(yàn)對(duì)照組及20 μg/mL Leptin處理72 h的MRC5細(xì)胞以及原代NOF細(xì)胞，胰酶消化，PBS充分洗滌。RiPA蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，40 μg/孔上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，低溫濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA封閉40 min，一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加HRP標(biāo)記二抗（1∶3 000），室溫孵育30 min，PBS充分洗掉背景后用增強(qiáng)ECL底物曝光。

1.10 膠原回縮試驗(yàn)對(duì)照組及20 μg/mL Leptin處理72 h的MRC5細(xì)胞以及原代NOF細(xì)胞計(jì)數(shù)6× 105個(gè)混入100 μL膠原蛋白懸液（含68.75 μL DMEM/F-12培養(yǎng)基，0.72 μL NaOH（1 mol/L），31.25 μL鼠尾膠原），加入低黏附24孔板中。放置0 h和12 h后在顯微鏡下分別拍照，膠原面積用Image J軟件定量，回縮能力描述為占原始面積的百分?jǐn)?shù)，每個(gè)樣本均有3個(gè)復(fù)孔。

1.11 動(dòng)物試驗(yàn)計(jì)數(shù)1×106卵巢癌細(xì)胞SKOV3接種于NOD?SCID免疫缺陷小鼠卵巢包膜，隨機(jī)分為IgG對(duì)照組及Leptin中和抗體處理組（每組12只老鼠）。接種后第1天開始每天1次腹腔給10 mg/kg IgG（對(duì)照組）或20 mg/kg Leptin中和抗體（處理組）持續(xù)1周；接種后第3天取兩組小鼠腹腔沖洗液，分離細(xì)胞成分后標(biāo)記兔抗PDGFRB抗體（1∶50），4℃孵育0.5 h，再用預(yù)冷PBS洗2遍后標(biāo)記FITC標(biāo)記羊抗兔（1∶100），流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)比較兩組PDGFRB+細(xì)胞含量差異；接種后第7天取兩組小鼠大網(wǎng)膜組織石蠟包埋后，行H&E切片染色顯微鏡下觀察比較微轉(zhuǎn)移灶形成情況；接種后第30天，將各組老鼠麻醉后處死終止實(shí)驗(yàn)比較腹腔腫瘤播散情況。所有動(dòng)物相關(guān)操作符合動(dòng)物試驗(yàn)倫理規(guī)范。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每次試驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量數(shù)據(jù)用形式表示，組間差異比較采用非配對(duì)student′st檢驗(yàn)，應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌惡性腹水中成纖維細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性行為高級(jí)別漿液性卵巢癌患者腹水中腫瘤細(xì)胞大多以球體形式存在，流式分選得到了PDG?FRB+的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞成典型的長梭形，這些細(xì)胞特異性的表達(dá)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白aSMA（圖1A）。這些腹水來源的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞作為驅(qū)化細(xì)胞能顯著增加卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OV90的體外侵襲能力（圖1B）；同時(shí)在系膜撕開試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)腹水來源成纖維細(xì)胞不但能顯著增加腫瘤球體大小，也能顯著增加卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OV90的系膜撕開能力（圖1C）。這些結(jié)果表明如同腫瘤原位轉(zhuǎn)移病灶一樣，卵巢癌患者惡性腹水中也大量存在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，這些腫瘤間質(zhì)細(xì)胞能夠顯著增加卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

圖1 卵巢癌患者腹水中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力Fig.1 Malignant ascites?derived CAFs facilitates ovarian cancer cell metastasis

2.2 細(xì)胞因子Leptin在惡性腹水中大量表達(dá)ELISA檢測(cè)了12例良性卵巢腫瘤和16例惡性卵巢癌腹水中Leptin的表達(dá)水平差異，良性病變中Leptin表達(dá)水平為（132.1±15.6）pg/mL，惡性腹水中為（576.4±60.4）pg/mL，兩者具有顯著的表達(dá)差異（P＜0.001，圖2A）。因?yàn)長eptin主要通過結(jié)合其受體LEPR而發(fā)揮作用，在結(jié)腸癌顯微切割芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)中比較了LEPR在微環(huán)境中幾種主要成分細(xì)胞表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)相比腫瘤上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)更高的LEPR（圖2B）。這些結(jié)果表明Leptin在卵巢癌惡性腹水中特異性高表達(dá)，很有可能作用于間質(zhì)成纖維細(xì)胞并調(diào)控起活化進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌腹腔播散。

2.3 Leptin促進(jìn)間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化成纖維細(xì)胞的持續(xù)性活化是腫瘤間質(zhì)促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。在成纖維細(xì)胞細(xì)胞系MRC5和原代分離卵巢成纖維細(xì)胞NOF中，外源性Leptin細(xì)胞因子能夠促進(jìn)陳纖維細(xì)胞的骨架伸展，顯著增加細(xì)胞面積（圖3A）；同時(shí)，Leptin添加能夠顯著增加腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白如α?SMA、FAP及PDGFRB在MRC5和NOF中的表達(dá)（圖3B）。在膠回縮試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，Leptin能顯著增加MRC5和NOF細(xì)胞回縮重塑細(xì)胞外基質(zhì)的能力（圖3C）。這些試驗(yàn)表明Leptin能夠調(diào)控成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，也表明Leptin可能作為一個(gè)潛在的之類卵巢癌腹腔播散種植的治療靶點(diǎn)。

圖2 卵巢腫瘤良惡性腹水中Leptin及腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞成分Leptin受體的表達(dá)情況Fig.2 Leptin expression in benign/malignant ascites and Leptin receptor expression in variant cell types of tumor microenvironment

圖3 Leptin促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化Fig.3 Leptin promotes malignant transformation of stromal firboblasts

2.4 早期腹腔應(yīng)用Leptin中和抗體對(duì)卵巢癌腹腔播散的影響為觀察腹腔中Leptin對(duì)間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化及對(duì)卵巢癌腹腔種植播散的影響，建立了卵巢癌原位種植模型，SKOV3細(xì)胞原位注射后，處理組開始腹腔每天給Leptin中和抗體持續(xù)1周，然后在不同時(shí)間段監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展情況（圖4A）。接種后第3天，在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中取腹腔沖洗液流式檢測(cè)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞含量。結(jié)果表明，Leptin處理組PDGFRB+活化成纖維細(xì)胞含量顯著低于IgG對(duì)照組（圖4B）。接種后第7天，在IgG對(duì)照組和Leptin封閉抗體實(shí)驗(yàn)組中取大網(wǎng)膜和腸系膜組織檢測(cè)微小轉(zhuǎn)移灶大小。結(jié)果表明，Leptin處理組微小轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和大小顯著低于IgG對(duì)照組（圖4C）。接種后第30天，在IgG對(duì)照組和Leptin封閉抗體實(shí)驗(yàn)組中白光下觀察卵巢腫瘤細(xì)胞腹腔播散情況。結(jié)果表明，Leptin處理組腹腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和大小顯著低于IgG對(duì)照組（圖4D）。這些結(jié)果表明卵巢癌患者惡性腹水中Leptin參與了調(diào)控腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞活化及腫瘤細(xì)胞種植過程，為卵巢癌的腹腔侵襲轉(zhuǎn)移過程提供了良好的微環(huán)境。

3 討論

卵巢癌主要的轉(zhuǎn)移途徑是播散種植，即腫瘤細(xì)胞從原位剝脫，在腹腔中被不斷改造獲得生存潛能到達(dá)遠(yuǎn)處定值并形成新的病灶的過程。剝脫的腹水腫瘤細(xì)胞在腹腔脫離細(xì)胞外基質(zhì)的狀態(tài)下，通過聚集抱團(tuán)形成多細(xì)胞球體放大生存信號(hào)。同時(shí)，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中腫瘤微環(huán)境被活化，大量細(xì)胞因子和活化間質(zhì)細(xì)胞協(xié)調(diào)腫瘤侵襲過程。在腫瘤原位轉(zhuǎn)移實(shí)體病灶中，成纖維細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞釋放的TGFβ1活化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，后者繼而釋放大量細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)程[11]。腹水作為卵巢癌侵襲播散的重要階段，其中成纖維細(xì)胞的活化狀態(tài)，以及其對(duì)腹水腫瘤細(xì)胞的調(diào)控對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲至關(guān)重要。本文旨在研究腹水中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)及其對(duì)卵巢癌腹腔播散種植的影響。

的確，如同在腫瘤原位轉(zhuǎn)移病灶中一樣，腹水中大量存在活化的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。這些腹水來源的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲及系膜撕開能力，從而加速腹腔侵襲過程。腹水中這些腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可能來自原位剝脫而來，或惡性轉(zhuǎn)化的系膜細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞以及骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞[12]。這表明腹水微環(huán)境中，除了細(xì)胞因子成分，間質(zhì)成纖維細(xì)胞也促進(jìn)了卵巢癌的腹腔播散過程。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Leptin在惡性腹水中特意性高表達(dá)，且Leptin受體在成纖維細(xì)胞表面高表達(dá)，提示Leptin很可能影響調(diào)控成纖維細(xì)胞的活化過程。的確，Leptin能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞細(xì)胞系MRC5及正常卵巢成纖維細(xì)胞NOF表達(dá)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞特異標(biāo)志蛋白，促進(jìn)其回縮基質(zhì)能力。鑒于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵作用和Leptin的潛在調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞活化作用，筆者在卵巢癌原位種植模型中觀察到早期腹腔中和Leptin能夠顯著抑制腹腔活化成纖維細(xì)胞數(shù)量及腹腔播散種植結(jié)局。以往關(guān)于Leptin在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用大多從肥胖女性卵巢癌發(fā)生易感性的角度探討其對(duì)卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中作用，或從Leptin作為細(xì)胞因子活化腫瘤生存通路惡性轉(zhuǎn)化卵巢腫瘤細(xì)胞角度探討其對(duì)卵巢癌進(jìn)展的影響[13-14]；本研究關(guān)于Leptin調(diào)控成纖維細(xì)胞活性的發(fā)現(xiàn)彌補(bǔ)了之前Leptin調(diào)控腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，表明其具備調(diào)控上皮及間質(zhì)細(xì)胞活化的雙重作用。在今后的研究中，還需要進(jìn)一步對(duì)Leptin調(diào)控成纖維細(xì)胞活化進(jìn)行機(jī)制研究及其對(duì)微環(huán)境中其他成分如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞活化的調(diào)控作用。

總之，本研究在卵巢癌惡性腹水中發(fā)現(xiàn)大量腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和系膜撕開能力；同時(shí)腹水中Leptin參與維持成纖維細(xì)胞的持續(xù)性活化，早期干預(yù)Leptin有望成為遏制卵巢癌腹腔播散的靶點(diǎn)。然而還需要進(jìn)一步探究靶向Leptin對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞組織的影響，確定其作為靶向治療的可行性和安全性，希望靶向腹水成纖維細(xì)胞活化或Leptin成為改善卵巢癌腹腔播散結(jié)局的有效手段。