黃金枝 鄧真華 俞燕芳 胡桂萍彭曉虹 杜賢明 曹紅妹 胡麗春

( 1.江西省蠶桑茶葉研究所330202; 2.江西省蠶桑工程技術(shù)研發(fā)中心)

桑椹系?？浦参锷５某墒旃麑?shí)，又名桑果、桑實(shí)和桑棗。桑椹屬漿果類(lèi)型，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的花色苷、白藜蘆醇等黃酮類(lèi)活性成分以及多糖、氨基酸、碳水化合物、有機(jī)酸、維生素、礦物質(zhì)等多種基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分[1]，是制作現(xiàn)代食品和保健產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)天然原料[2～3]。

桑椹收獲時(shí)間比較集中，果皮薄，汁液多，組織嬌嫩，在收獲和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中很容易軟化、腐爛，并且嚴(yán)重影響它的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。通過(guò)了解桑椹發(fā)育成熟期間的營(yíng)養(yǎng)活性成分含量變化規(guī)律，能夠?yàn)樯ｉ┻m時(shí)采摘和實(shí)施相應(yīng)的保鮮技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

試驗(yàn)對(duì)象為無(wú)籽果桑大十，采自江西省蠶桑茶葉研究所果桑園。對(duì)桑椹果實(shí)的發(fā)育期進(jìn)行劃分，依次為全綠期、半粉紅期、粉紅期、全紅期和紫黑期[4]。同一發(fā)育期采摘桑椹2 kg，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，存放在-80℃冰箱中備用。測(cè)定時(shí)將其研磨混勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定重量，重復(fù)取3次，用于成熟過(guò)程中DNJ和花青素含量測(cè)定。

生物堿標(biāo)準(zhǔn)品為1-脫氧野尻霉素，花青素標(biāo)準(zhǔn)品為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷。鹽酸、硼酸鉀、FMOC-Cl、乙腈、甘氨酸、醋酸、乙醇、偏磷酸、磷酸為色譜純。

設(shè)備：Agilent 1260高效液相色譜(美國(guó)安捷倫科技公司)。

1.2 桑椹生物堿的測(cè)定[5]

1.2.1 樣品制備

取新鮮桑椹10g，研磨均勻，得到桑椹漿，取10g桑椹漿于50mL離心管中，加入0.05mol/L鹽酸溶液10mL，渦旋提取3min，離心15min(轉(zhuǎn)速12 000r/min)，取上清液，同法重復(fù)提取一次，離心，合并2次提取液并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，蒸餾水定容即得。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及工作曲線(xiàn)建立

準(zhǔn)確稱(chēng)取20mgDNJ標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，加超純水溶解并定容，即得0.8g/L的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至質(zhì)量濃度為60μg/mL、120μg/mL、180μg/mL、240μg/mL、300μg/mL、480μg/mL備用。以DNJ的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程。

1.2.3 衍生化反應(yīng)[5]

取DNJ提取液(或DNJ標(biāo)準(zhǔn)液)100μL，再加入5mmol/L的FMOC-Cl(溶解于乙腈中)200μL，混勻后于25℃水浴20min。加入1mol/L甘氨酸100μL中和剩余的FMOC-Cl以終止反應(yīng)，加入1%醋酸100μL及超純水400μL，以0.45μm微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液備測(cè)?？瞻讓?duì)照以蒸餾水代替DNJ提取液進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

1.2.4 HPLC檢測(cè)條件[5]

色譜柱C18柱(150mm×4.6mm×5μm)；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)254nm，發(fā)射波長(zhǎng)322nm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸(體積比50:50)；流速1.0mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL。

1.3 桑椹花青素的測(cè)定[6]

1.3.1 樣品制備

取新鮮桑椹10g，研磨均勻，得到桑椹漿，取5g桑椹漿加入20mL酸性乙醇(含1%HCl)，超聲波提取30min，12 000r/min離心10min，取上清液作檢測(cè)樣品。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及工作曲線(xiàn)建立

準(zhǔn)確稱(chēng)取C3G標(biāo)準(zhǔn)品1mg和C3R標(biāo)準(zhǔn)品1mg，分別加入1mL和500μL混合液(無(wú)水乙醇：偏磷酸：超純水=3:1:6)作為儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆?。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3 HPLC檢測(cè)條件[6]

譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)。流動(dòng)相A為乙腈，B為0.4%磷酸。流動(dòng)相A洗脫程序?yàn)椋?～10min，9%～15%乙腈；10～20min，15%～35%乙腈；20～24min，35%～9%乙腈。流動(dòng)相B洗脫程序?yàn)椋?～10min，91%～85%磷酸；10～20min，85%～65%磷酸；20～24min，65%～91%磷酸。流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)520nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑椹成熟過(guò)程中DNJ含量變化

采用HPLC法對(duì)桑椹成熟期間的DNJ含量進(jìn)行檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，得到DNJ含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)y=6.667x+35.26(R2=0.999)，通過(guò)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出桑椹成熟過(guò)程中DNJ的含量，所得結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖1所示，桑椹從全綠期到紫黑期，桑椹中的 DNJ含量逐漸下降，至紫黑期含量為零。即全綠期 DNJ 含量較高，而隨著桑椹的不斷成熟，DNJ 含量逐漸減少，說(shuō)明 DNJ主要存在于其幼嫩和重要的組織器官之中，如嫩葉、幼果等。全綠期桑椹中DNJ含量較高，但果品質(zhì)較差，多糖和黃酮含量較少，不適合桑椹深加工，DNJ含量也遠(yuǎn)低于桑葉，也不合適作為生產(chǎn) DNJ 產(chǎn)品的原料開(kāi)發(fā)[7]。

圖1 桑椹成熟過(guò)程中DNJ 含量變化

2.2 桑椹成熟過(guò)程中花青素含量變化

采用HPLC法對(duì)桑椹成熟過(guò)程中的花青素含量進(jìn)行檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，得到C3G含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)y=3639x-4.381(R2=0.999)，C3R含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)y=6756.5x+49.243(R2=0.997)。通過(guò)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算桑椹成熟期間C3G和C3R的含量，結(jié)果如圖2所示。桑椹在成熟過(guò)程中C3G和C3R含量都呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在桑椹半粉紅期前均緩慢增加，粉紅期后2種花青素的含量急劇上升；2種花青素的含量差異很大，C3R含量高于C3G含量。桑椹在成熟過(guò)程中，外觀(guān)顏色會(huì)由綠色變?yōu)榉奂t色，再到紫紅色，最后變?yōu)樽虾谏?，這種外觀(guān)顏色的變化，主要有兩方面的原因：①在成熟過(guò)程中葉綠素逐漸降解，花青素含量逐漸積累；②隨著pH值上升，花色苷的色調(diào)發(fā)生了改變。

圖2 桑椹成熟過(guò)程中花青素含量的變化

3 討論

生物堿DNJ作為一種高效的α-糖苷酶抑制劑，是桑樹(shù)體內(nèi)次生代謝產(chǎn)生的一種重要防御物質(zhì)[8～9]。從本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果可以看出，桑椹在全綠期的DNJ含量很高，而隨著桑椹逐漸成熟，DNJ含量逐漸減少。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在桑椹全綠期花青素的含量幾乎為0，隨后逐漸緩慢增加，到粉紅期開(kāi)始大量合成花青素，其含量迅速增加，紫黑期桑椹中花青素C3G和C3R的含量均達(dá)到最大值，這與在葡萄、荔枝等果實(shí)中的研究結(jié)果一致[10～11]。在桑椹成熟期間，DNJ含量逐漸減少，而C3G和C3R的含量逐漸增多，因此，生產(chǎn)上需根據(jù)加工桑椹食品的保健功效采收不同成熟期的桑椹做原料。