朱 萌 翟華亮 趙婉瑩張 寧 * 和水祥*

（1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內科，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科，寧夏 銀川 750004；3. 解放軍第三二三醫(yī)院消化內科，陜西 西安 710061；4. 西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院消化內科，陜西西安 710061）

RNA是生命活動的中心。其中，非編碼RNA分子已被越來越多的證據證明其在生命活動中起著不可替代的作用。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類主要的內源性非編碼單鏈RNA分子，僅17~22個核苷酸長度，通過識別1個或多個mRNA分子的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)而 在 轉 錄 后 水 平 抑 制mRNA翻譯或降解mRNA[1-2]。這一經典理論明確了miRNA下游的調控機制，集中于miRNA與靶基因的相互作用，對于miRNA自身如何被調控的機制卻鮮見報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-106a靶向TIMP2調控胃癌細胞的侵襲轉移，是腫瘤特異性RNA分子，可能成為預防和治療進展期胃癌的關鍵靶點[3]。然而，正如現(xiàn)有大多數研究報道一樣，關于miR-106a的研究多局限于對其靶基因的鑒定和細胞表型的檢測上，而對其自身轉錄調控機制的認識仍知之甚少。因此，本研究擬從miRNA上游水平入手，構建miR-106a啟動子的熒光素酶報告質粒，篩選并驗證能夠與啟動子結合并調控啟動子轉錄的轉錄因子Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)；構建KLF4過表達質粒，探索KLF4在上游轉錄水平對miR-106a成熟體的表達調控及對下游事件胃癌細胞遷移能力的影響，以期為深入闡明miR-106a在胃癌中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、Trizol購自TaKaRa公司，T4連接酶、 K pn I、XhoI購自Thermo公司，Biospin DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司，Plasmid Mini Kit I質粒提取試劑盒購自Omega公司，胰蛋白棟、酵母粉購自Oxiod公司，逆轉錄試劑盒、Bestar qPCR RT Kit購自DBI?Bioscience公司，胎牛血清購自Gibco公司，DMEM、RPMI-1640購自Hyclone公司，Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。人永生化胃黏膜上皮細胞株GES、人胃中分化腺癌細胞株SGC-7901及HEK293T購自上?？茖W院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 miR-106a啟動子野生型和突變型報告質粒的構建 根據miR-106a啟動子和載體pGL3-basic的序列設計引物，見表1。200 μL GES細胞，采用Biospin DNA提取試劑盒提取模板DNA。目的基因PCR擴增體系：PrimeSTAR?HS DNA聚合酶0.25 μL，5×PrimeSTAR緩沖液5 μL，dNTP Mix 2 μL，F(xiàn)/R引物各0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 15.75 μL ，共25 μL。反應條件：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min。miR-106a啟動子PCR 產物回收后與pGL3-basic載體雙酶切，酶切體系：PCR回收產物/載體10 μL，Kpn I 1.5 μL， X ho I 1.5 μL，10× 緩 沖液5 μL，ddH2O 32 μL ，共50 μL，37 ℃水浴2 h。使用T4 DNA 連接酶連接目的片段與載體。連接產物轉化大腸桿菌D H5α感受態(tài)細胞，挑選菌落，接種于裝有800 μL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的培養(yǎng)基中，取1 μL菌液為模板，行菌落PCR鑒定，PCR體系：rTaq 0.5 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，F(xiàn)/R 引 物各0.4 μL，ddH2O 8.1 μL，共20 μL。選取陽性克隆的菌液按1∶100的比例接種至5 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)LB培養(yǎng)基中，洗脫質粒。重組質粒酶切鑒定：質粒3 μL， K pn I 0.4 μL，XhoI 0.4 μL，10× 緩 沖液1 μL，ddH2O 5.2 μL ，共10 μL，37℃、2 h。酶切產物行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、送測序。

表1 miR-106a 啟動子野生型和突變型引物序列

1.2.2 KLF4過表達質粒的構建 根據 K LF4基因和載體pcDNA3.0的序列設計引物。KLF4-F：GGGGTACCA TGAGGCAGCCACCTGGC；KLF4-R：CCGCTCGAGTT AAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGG。Trizol 法提取GES細胞 模 板RNA。逆轉錄體系：5×RT 緩 沖液4 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，Primer Mix 1 μL，RNase Free ddH2O 4 μL，RNA 1 μg 10 μL ，共20 μL。反應條件：37 ℃、60 min，98 ℃ 、 10 min。PCR擴增體系：PrimeSTAR?HS DNA聚合酶0.25 μL，5×PrimeSTAR 緩沖液5 μL，dNTP Mix 2 μL，F(xiàn)/R引物各0.5 μL，模板 1 μL，ddH2O 15.75 μL ，共25 μL。反應條件：94 ℃、5 min，94℃、30 s，62 ℃、30 s，72 ℃、 2 min，72 ℃、5 min。后續(xù)步驟同上。

1.2.3 雙熒光素酶系統(tǒng)驗證miR-106a轉錄因子KLF4 HEK293T細胞以8×105/mL接種于24孔培養(yǎng)板，分4組：pmiR-106a-WT+KLF4+-pcDNA3.0，pmiR-106a-WT+KLF4--pcDNA3.0，pmiR-106a-MUT+KLF4+-pcDNA3.0，pmiR-106a-MUT+KLF4--pcDNA3.0。使用LipofectamineTM2000轉染，KLF4過表達質粒/miR-106a啟動子質粒濃度0.8 μg，轉染后48 h測定熒光值。每孔細胞加入100 μL Passive裂解液，室溫輕微振搖15 min，收集細胞裂解液，GloMax生物發(fā)光檢測儀讀取背景值2 s，每樣品加入100 μL LAR Ⅱ工作液，讀值2 s，再加入100 μL Stop&Glo?Reagent，讀值2 s，計算相對熒光活性值。

1.2.4 qPCR檢測胃癌組織中miR-106a、KLF4 mRNA表達水平 收集2017年1月—2017年11月于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院行胃癌根治術切除的胃組織標本，癌灶和對應癌旁組織(距癌灶中心≥5 cm)各30例。所有患者術前均已經胃鏡活檢確診為胃腺癌，并通過醫(yī)學倫理委員會批準并簽署知情同意書。使用Trizol法提取RNA，RNA質量管控采用美國Bioteck公司Epoch超微量微孔板分光光度計檢測核酸純度， D ( 2 60)/D(280)比值在1.8~2.0認為符合要求。KLF4-F：CGTTGAACTCCTC GGTCTC；KLF4-R：GACGCCTTCAGCACGAACT。miR-106a逆轉錄引物：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCA ATTCAGTTGAGCTACCTGC；miR-106a-F：ACACTCC AGCTGGGAAAAGTGCTTACAGTGCA。統(tǒng)一的反向引物CTCAACTGGTGTCGTGGA。內參分別為GAPDH、U6。逆轉錄條件：37 ℃、15 min；98 ℃、5 min。PCR反應條件：95 ℃、2 min，94 ℃、20 s，58 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)。熔融解曲線分析：94 ℃、30 s，65 ℃、30 s，94 ℃、30 s。重復3次。以2-??CT計算基因相 對表達量。

1.2.5 Transwell法檢測人胃癌細胞遷移能力 人胃癌細胞株SGC-7901按2×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板，分4組：miR-106a mimic，mimic NC，miR-106a mimic+KLF4-pcDNA3.0，miR-106a mimic+pcDNA3.0 vector。使用LipofectamineTM2000轉染，收集細胞，安裝小室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后固定染色，顯微鏡下選取10個互不重疊高倍視野計數。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.-0統(tǒng) 計軟件進行數據分析。計量資料的統(tǒng)計描述采用x± s 表 示，兩樣本均數的比較采用t檢驗(t-test)，多個樣本均數的比較采用方差分析(One-Way AVONA)，變量之間關系的比較采用直條圖表示，采用箱式圖表示變量原始數據的分布特征，以 α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 生物信息學預測miR-106a上游啟動子和轉錄因子

使用美國加州大學圣克魯茲分校生物信息數據庫(University of California Santa Cruz，UCSC genome browser)檢索hsa-miR-106a啟動子序列，獲得miR-106a上游啟動子區(qū)域2 000 bp序列。miR-106a啟動子序列和突變位點見圖1。使用轉錄因子數據庫JASPAR，選擇脊椎動物JASPAR CORE Vertebrata，篩選調控miR-106a的轉錄因子，考慮結合位點與起始位點近、理論值達90%、CDS區(qū)片段長度等因素確定KLF4作為miR-106a轉錄因子的研究對象，并獲得轉錄因子與啟動子結合的位點。

圖1 miR-106a 上 游 2 0 00 b p 啟 動子序列(http: //genome.ucsc.edu/)

2.2 miR-106a啟動子報告質粒的鑒定

如圖2所示，miR-106a啟動子重組質粒PCR產物電泳圖譜顯示目的基因條帶位于100~250 bp之間，理論值191 bp，符合預期片段大小，初步證明miR-106a啟動子擴增成功。雙酶切電泳圖顯示pmiR-106a-WT位于200 bp左右，pGL3 basic位于加樣孔處(4 000 bp左右，原本4 818 bp)，提示miR-106a啟動子野生型重組質粒構建符合預期。miR-106a啟動子定點突變重組質粒送測序后顯示已成功在目的突變位點實現(xiàn)突變。

2.3 KLF4過表達質粒的鑒定

圖2 miR-106a啟動子報告質粒的鑒定

如圖3所示，KLF4過表達質粒PCR產物電泳圖顯示電泳條帶位于1 000~2 000 bp之間，理論值1 440 bp，提示 K LF4基因擴增順利，雙酶切電泳圖顯示KLF4基因酶切產物1 500 bp左右，大片段pcDNA3.0位于加樣孔下方，原本 5 427 bp，提示KLF4重組質粒構建符合預期。

2.4 miR-106a轉錄因子KLF4的鑒定

雙熒光素酶系統(tǒng)檢測結果如圖4所示，pmiR-106a-WT+KLF4+-pcDNA3.0和pmiR-106a-WT+KLF4--pcDNA3.0，在應用KLF4過表達質粒處理后，miR-106a野生型報告質粒熒光素酶活性下降，t檢驗得出，與空載體相比，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-24.378，P=0.000)，說明過表達的KLF4對報告載體上miR-106a啟動子下游的螢火蟲熒光素酶基因的表達有抑制作用。pmiR-106a-MUT+KLF4+-pcDNA3.0和pmiR-106a-MUT+ KLF4--pcDNA3.0，KLF4過表達處理后，miR-106a啟 動子突變型報告基因活性下降不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(t= - 0.647，P =0.553)，說明過表達KLF4對miR-106a突變型報告基因的熒光素酶活性無明顯影響。

2.5 KLF4 mRNA和miR-106a在人胃癌組織中的表達水平

qPCR檢測結果如圖5所示，KLF4 mRNA在胃癌組織中的相對表達量為0.716±0.624，配對t檢驗得出，二者 差 異具有統(tǒng)計學意義(t= 4.228， P=0.000)，說明KLF4 mRNA在胃癌組織中呈低水平表達。miR-106a的相對表達量為3.367±2.165，t檢驗得出兩者 差 異具有統(tǒng)計學 意 義(t= -6.259， P=0.000)，說明miR-106a在胃癌組織中高表達。提示miR-106a與轉錄因子KLF4在人胃癌中可能具有負調控關系。

2.6 miR-106a的表達調控對人胃癌細胞遷移能力的影響

人胃癌SGC-7901細胞行transwell小室實驗，結果如圖6所示，miR-106a mimic組穿膜細胞數量為100.50± 53.56， mimic NC組 為 49.90± 12.53， miR-106a mimic+KLF4-pcDNA3.0組為67.30±18.26，miR-106a mimic+pcDNA3.0 vector組為99.50±37.28。方差分析得出 F= 5.239， P=0.004，說明不同處理的 4組細胞遷移能力不全相同。與mimic NC組相比，miR-106a mimic組細胞數量顯著增多(P=0.002)；但當合并KLF4處理后，miR-106a mimic+KLF4-pcDNA3.0 組細胞數量減少，與miR-106a mimic組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.038)，而KLF4空載體對照組細胞數量無明顯變化(P=0.949)。提示miR-106a mimic對胃癌細胞遷移有促進作用，但該促進作用可被 KLF4部分阻遏。

3 討 論

miRNA的表達失控與多種人類疾病尤其是惡性腫瘤密切相關[4]。miR-106a是由約70個核苷酸長度的前體miR-106a~363經Dicer酶剪切形成約22個核苷酸長度的產物，構成miR-17家族成員之一，該家族成員在大多數的惡性腫瘤中被認為具有癌基因樣的作用[5]。本文研究miR-106a的自身表達調控機制。之前有學者報道通過構建pre-miR-122啟動子報告質粒轉染小鼠肝星狀細胞HSCs，以熒光素酶活性值可以初步判斷miRNA的表達調控機制[6]。本研究選擇轉錄因子KLF4與miR-106a啟動子的相關關系開展研究，探討miR-106a的表達調控對人胃癌細胞生物學功能的影響。

通常，啟動子區(qū)域位于轉錄起始位點(transcription start site，TSS)附近，主要是在TSS上游1 kb的范圍內。已知，miRNA的轉錄主要是由Ⅱ類RNA聚合酶(RNA-pol)介導[7]。RNA-polⅠ和Ⅱ多位于TSS上游，RNA-polⅢ位于TSS下游[8]。本研究于miR-106a上游2 000 bp序列預測啟動子區(qū)域，序列分析發(fā)現(xiàn)，其廣泛富含TATA盒 (TATA box)、 CAAT盒 (CAAT box)和 GC(GC box)等真核生物基因上游順式作用元件，據此推測miR-106a轉錄可能由RNA-polⅠ或RNA-polⅡ介導。根據真核生物的轉錄起始是由能直接或間接辨認結合轉錄上游區(qū)段的反式作用因子啟動、控制基因轉錄。而反式作用因子中，轉錄因子是與RNA聚合酶直接或間接結合的。故針對轉錄因子，篩選在胃癌中異常表達并能夠與miR-106a啟動子結合的轉錄因子KLF4作為研究對象，使用熒光素酶報告基因技術考察KLF4對miR-106a啟動子的調控。結果顯示KLF4的過表達載體對miR-106a啟動子的野生型報告基因的熒光素酶活性具有明顯的抑制作用，但對突變型質粒的作用不明顯，提示miR-106a啟動子區(qū)含有可能與轉錄因子KLF4結合的位點。KLF4是一種鋅指結構蛋白，隸屬于轉錄因子家族[9-10]。很多研究認為KLF4在多種類型實體腫瘤中是作為一種抑癌基因的角色而存在。KLF4的敲低具有促進腫瘤細胞生長、遷移和黏附的作用[11]，激活KLF4則減少轉移灶周遭環(huán)境的形成悖于轉移，且是一種KLF依賴性的過程[12]。有研究報道KLF4可與miR-544的啟動子序列互補結合調節(jié)miR-544在宮頸癌中的表達[13]。但KLF4與miR-106a在胃癌中的調控關系尚未見報道。我們此次在人胃癌組織中對比研究KLF4的表達水平，發(fā)現(xiàn)KLF4在胃癌組織中低表達，結合miR-106a在胃癌組織中高表達，提示在胃癌中，KLF4表達降低，KLF4結合于miR-106a啟動子區(qū)域，低表達的KLF4對miR-106a的抑制作用弱，miR-106a表達升高；當應用KLF4過表達載體使其表達升高后，KLF4發(fā)揮抑癌基因樣作用，在轉錄水平減少miR-106a野生型報告基因的熒光素酶活性，使miR-106a成熟體表達減少；再結合我們前期的研究結果，高表達的miR-106a在胃癌細胞中因具有顯著地促使癌細胞獲得更高水平的遷移能力的作用，使其在一定程度上體現(xiàn)促癌基因樣的表型特征，此次KLF4在上游水平對其啟動子的結合，負性調節(jié)其轉錄活性，致使在表觀現(xiàn)象上我們看到miR-106a對胃癌細胞的促癌基因樣作用得以削弱[3]，細胞的遷移能力下降，部分阻遏或一定程度逆轉胃癌細胞的侵襲性。

總之，本研究一定程度上揭示了轉錄因子KLF4與miR-106a啟動子的結合和調控關系，KLF4和miR-106a結合于上游轉錄位點可能在胃癌的侵襲轉移事件中發(fā)揮重要的調控作用，這將為進一步研究miRNA表達調控機制打開新窗口。