茍 練，張夢(mèng)云，劉科亮，龐定國(guó)，劉麗達(dá)，徐培渝，*

（1. 四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)食品衛(wèi)生與毒理學(xué)系，四川 成都 610041；2. 蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司藥代毒理部，北京 100085；3. 四川省疾病預(yù)防與控制中心毒理所，四川 成都 610041）

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)，又稱(chēng)2,4-D滴或2,4-D酸，是一種低毒型農(nóng)藥。其低劑量可作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)，提高果實(shí)率，并延緩果實(shí)衰老；高濃度時(shí)2,4-D可用作除草劑，鑒于此，被廣泛應(yīng)用于世界各地果蔬產(chǎn)業(yè)。2,4-D在自然界中不易分解，且隨著使用量的劇增，其殘留率大于分解率而積聚在土壤及空氣中，對(duì)機(jī)體和環(huán)境存在潛在危害。研究表明，2,4-D對(duì)皮膚和眼睛均有刺激作用，急性經(jīng)口毒性表現(xiàn)為神經(jīng)毒性，亞慢性毒性主要表現(xiàn)為對(duì)血液、肝、腎等毒性及抑制某些酶的活力，并能抑制某些蛋白質(zhì)的合成[1]；2,4-D會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致癌癥或者其他慢性疾病[2]。流行病學(xué)報(bào)告指出，長(zhǎng)期暴露2,4-D的農(nóng)民患非何杰金淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加[3-6]，帕金森與膀胱癌發(fā)病率也增加[7-9]。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于2,4-D的研究主要集中在發(fā)育毒性方面，涉及生殖毒性的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期接觸2,4-D可影響胎兒頭骨、胸骨、掌骨和跖骨骨化的延遲、泌尿生殖道畸形、吸收胎與死胎增多[10]。2,4-D還可干擾青蛙性激素和阻止蛙卵成熟[11]，抑制精子功能[12]，引起精子功能障礙和不孕癥等[13]。因此，本研究擬探討2,4-D對(duì)初斷乳SD大鼠生殖器官發(fā)育是否具有毒性以及毒作用的相關(guān)機(jī)制，為評(píng)價(jià)2,4-D的安全性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)剛斷乳(21 d)SD大鼠，體質(zhì)量50~70 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(川)2008-19。幼鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)，飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物房，許可證號(hào)SYXK(川)2011-043。動(dòng)物自由飲水和攝食，飼養(yǎng)室溫度控制在20~24 ℃，相對(duì)濕度保持在55%~65%之間。

1.2 受試物與主要試劑

2,4-D原藥購(gòu)自北京精華耀邦醫(yī)藥科技有限公司(純度98%，CAS號(hào)94-75-7)；卵泡刺激素(folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(luteotropic hormone， LH)、 雌 二 醇 (estradiol， E2)、 睪 酮(testosterone，T)定量檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)購(gòu)自德國(guó)拜耳醫(yī)藥公司；總膽固醇檢測(cè)試劑盒(酶法)購(gòu)自北京世紀(jì)沃德生物科技有限公司；蘇木精-伊紅染色(HE)試劑均購(gòu)自成都博奧維新生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和染毒方法

將SD幼鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)設(shè)2,4-D 低劑量組(18.125 mg/kg)、中劑量組(36.25 mg/kg)、高劑量組(72.5 mg/kg)3個(gè)染毒組和溶劑對(duì)照組，用1%羧甲基纖維素作為樣品溶劑，各組動(dòng)物按1 mL/100 g每天經(jīng)口灌胃1次，連續(xù)染毒28 d，每周稱(chēng)體質(zhì)量2次。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 一般觀察 每日觀察試驗(yàn)動(dòng)物的一般行為，大小便及中毒癥狀等。

1.4.2 生殖器官發(fā)育觀察 觀察并記錄每只雌性大鼠陰道開(kāi)口的時(shí)間，同時(shí)計(jì)算染毒28 d后雌性大鼠陰道開(kāi)口率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用真空采血管股動(dòng)脈取血5 mL后，將動(dòng)物處死，立即分離出雌鼠卵巢、子宮，雄鼠的附睪、睪丸，稱(chēng)取質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)，然后將臟器置入裝有40 mL 10%甲醛的細(xì)口瓶中固定。待檢標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，橫斷面切片，HE染色。

1.4.3 血清中性激素的測(cè)定 將股動(dòng)脈血800 r/min離心5 min，取血清上清液測(cè)定SD大鼠的FSH、LH、E2、T(利用德國(guó)西門(mén)子拜耳化學(xué)發(fā)光儀ADVIA Centaur進(jìn)行測(cè)定)和膽固醇(采用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行)含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.4 病理學(xué)觀察 將子宮、卵巢、睪丸和附睪固定于濃度為10%的甲醛溶液中，依次經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋之后切片(厚5 μm)，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采- 用 SPSS 17.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以x± s 表 示，組間比較采用方差分析，以Dunnett-t進(jìn)行各劑量組與對(duì)照組的兩兩比較；率的比較用 χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間各組動(dòng)物除72.5 mg/kg組以外，其余組動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài)良好，均未出現(xiàn)死亡。與對(duì)照組比較，在染毒28 d內(nèi)，2,4-D 18.125與36.25 mg/kg組大鼠染毒后體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)明顯差異，但72.5 mg/kg組動(dòng)物于染毒第7天起，體質(zhì)量增長(zhǎng)速度明顯較對(duì)照組有所減緩，36.25 mg/kg組雄鼠于染毒第21天體質(zhì)量增長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯減緩，至染毒28 d結(jié)束時(shí)，36.25 mg/kg組雄性大鼠、72.5 mg/kg組雄鼠和雌鼠體質(zhì)量較對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖1所示。

圖 染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響(- )12,4-D x s±

2.2 2,4-D染毒對(duì)大鼠睪丸、附睪、子宮、卵巢質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

隨著2,4-D染毒劑量的增加，睪丸、附睪、子宮和卵巢的濕質(zhì)量均呈遞減趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，72.5 mg/kg 2,4-D染毒組雄鼠睪丸和雌鼠子宮濕質(zhì)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2和圖3；但各染毒組大鼠上述各器官的臟器系數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P 均 >0.05)。

2.3 2,4-D染毒對(duì)雌性大鼠陰道開(kāi)口時(shí)間及開(kāi)口率的影響

對(duì)照組大鼠于染毒第11天(35日齡)開(kāi)始出現(xiàn)陰道開(kāi)口，染毒第14天(38日齡)所有大鼠的陰道開(kāi)口完畢；36.25 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠于實(shí)驗(yàn)染毒第8天(32日齡)即出現(xiàn)陰道開(kāi)口，且于第11天(35日齡)所有的大鼠陰道開(kāi)口完畢；而72.5 mg/kg 2,4-D染毒組大鼠于染毒第14天(38日齡)才出現(xiàn)陰道開(kāi)口，陰道開(kāi)口比僅為1/10。與對(duì)照組比較，36.25 mg/kg 2,4-D染毒組陰道開(kāi)口時(shí)間提前，72.5 mg/kg 2,4-D染毒組陰道開(kāi)口時(shí)間延遲且陰道開(kāi)口率較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 2,4-D染毒對(duì)雌性SD大鼠陰道開(kāi)口時(shí)間(日齡)及開(kāi)口率的影響(n =10)

2.4 2,4-D染毒對(duì)SD大鼠性激素水平的影響

各染毒組雄性大鼠T的含量隨著染毒劑量的增加，其含量逐漸降低，其中高劑量染毒組與對(duì)照組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而各染毒組雄性大鼠E2的含量隨著染毒劑量的增加，E2的含量逐漸升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；此外，各染毒組LH所測(cè)值均小于0.1，F(xiàn)SH所測(cè)值均小于0.3，與對(duì)照組間差異不明顯(P均>0.05)。而36.25 mg/kg染毒組雌性大鼠E2較對(duì)照組升高，高劑量染毒組雌性大鼠E2較對(duì)照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組雌性大鼠的T含量較對(duì)照組也降低，膽固醇含量較對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5 SD大鼠睪丸、附睪發(fā)育的組織學(xué)觀察

與對(duì)照組比較，各劑量組睪丸組織無(wú)明顯異常(圖4A~D)，而高劑量組附睪組織曲細(xì)精管內(nèi)(層數(shù))生精細(xì)胞較少，其他兩組無(wú)明顯異常(圖4E~H)。

2.6 SD大鼠卵巢、子宮發(fā)育的組織學(xué)觀察

與對(duì)照組比較，各劑量組卵巢組織無(wú)明顯異常(圖5A~D)，但72.5 mg/kg 2,4-D染毒組子宮腔略大，子宮壁略薄(圖5E~H)，其他組子宮無(wú)明顯異常。

與對(duì)照組(0)比 較，*P<0.05.

A：睪丸，對(duì)照組(×10)；B：睪丸，對(duì)照組(×40)；C：睪丸，72.5 mg/kg組 (×10)；D：睪丸，72.5 mg/kg組 (×40)；E：附睪，對(duì)照組(×10)；F：附睪，對(duì)照組(×40)；F：附睪，72.5 mg/kg組 (×10)；H：附睪，72.5 mg/kg組 (×40).

A：卵巢，對(duì)照組(×10)；B：卵巢，對(duì)照組(×40)；C：卵巢，72.5 mg/kg(×10)；D：卵巢，72.5 mg/kg(×40)；E：子宮，對(duì)照組(×4)；F：子宮，18.125 mg/kg組 (×4)；G：子宮，36.25 mg/kg組 (×4)；H：子宮，72.5 mg/kg組 (×4).

3 討 論

2,4-D可通過(guò)多種途徑進(jìn)入人體，并在體內(nèi)廣泛分布。在正常機(jī)體pH值下，2,4-D主要以離子的形式存在，通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)入到細(xì)胞當(dāng)中。我國(guó)2001年新頒布的《飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》將2,4-D的極限值規(guī)定為0.03 mg/L[14]，2,4-D原藥大鼠急性經(jīng)口LD50為600 mg/kg，200 ppm(11.25 mg/kg)會(huì)產(chǎn)生亞慢性毒性[15]，2,4-D最大耐受劑量為675 mg/kg(死亡率大于67%)[16]。在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中，2,4-D劑量50 mg/kg可超過(guò)腎臟陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，產(chǎn)生全身毒作用[17]。鑒于此，確定了本研究的劑量設(shè)置(0、18.125、36.25、72.5 mg/kg)。

本研究采用體質(zhì)量、器官濕質(zhì)量、臟器系數(shù)和陰道開(kāi)口時(shí)間等觀察指標(biāo)結(jié)合病理學(xué)指標(biāo)以及血清激素指標(biāo)從方法學(xué)上綜合評(píng)價(jià)了2,4-D對(duì)SD雌鼠的生殖毒性，具有客觀性和全面性。動(dòng)物體質(zhì)量指標(biāo)能綜合反映動(dòng)物的一般生長(zhǎng)發(fā)育情況，本研究72.5 mg/kg組從第14天起雌鼠體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組，雄鼠36.25 mg/kg組 第 21、28天體質(zhì)量也顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明一定劑量的2,4-D會(huì)對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生毒性作用。72.5 mg/kg 2,4-D染毒組雄鼠睪丸和雌鼠子宮濕質(zhì)量均明顯降低(P<0.05)，但各染毒組大鼠生殖器官臟器系數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，說(shuō)明本研究劑量設(shè)置在保證了無(wú)明顯毒性的基礎(chǔ)上，證實(shí)了高劑量2,4-D對(duì)生殖器官的發(fā)育具有毒性影響。陰道開(kāi)口時(shí)間指標(biāo)作為青春期開(kāi)始的標(biāo)志長(zhǎng)久以來(lái)對(duì)研究動(dòng)物生殖毒性判定具有重要意義，36.25 mg/kg組雌鼠陰道開(kāi)口時(shí)間明顯早于對(duì)照組(P<0.05)，使大鼠青春期提前；而72.5 mg/kg組陰道開(kāi)口時(shí)間則明顯滯后于對(duì)照組(P<0.05)，結(jié)合高劑量組子宮濕質(zhì)量及體質(zhì)量均低于對(duì)照組說(shuō)明高劑量組延遲了雌鼠的生殖器官的發(fā)育。此外，高劑量組在病理結(jié)果中雌鼠子宮腔增大，子宮壁變薄，且雄鼠附睪組織曲細(xì)精管內(nèi)(層數(shù))生精細(xì)胞減少，進(jìn)一步證實(shí)了高劑量2,4-D會(huì)對(duì)大鼠生殖器官產(chǎn)生毒性作用。

性激素對(duì)機(jī)體至關(guān)重要，其具有促進(jìn)性器官成熟、副性征的發(fā)育以及維持正常性功能等作用。性激素主要包括雌性動(dòng)物的卵巢分泌雌激素與孕激素，雄性動(dòng)物的睪丸主要分泌睪酮。性激素的合成以膽固醇為前體，通過(guò)縮短側(cè)鏈，產(chǎn)生21C的孕烯醇酮或者是孕酮，去側(cè)鏈，衍變?yōu)?9C的雄激素，最后通過(guò)A環(huán)的芳香化，生成18C的雌激素[18]。

本研究結(jié)果顯示，72.5 mg/kg的2,4-D可增加雌性大鼠血清中膽固醇的含量，降低E2和T的含量，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合性激素在體內(nèi)的合成過(guò)程，我們推測(cè)2,4-D可能是通過(guò)抑制膽固醇轉(zhuǎn)換成睪酮的過(guò)程中所需的某種因子，進(jìn)而使雌二醇的合成過(guò)程受到抑制。此外，對(duì)于處于生長(zhǎng)發(fā)育期的大鼠，性激素分泌的含量會(huì)直接影響進(jìn)其生殖器官的發(fā)育，因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下，E2和T含量降低同時(shí)，也觀察到2,4-D可使動(dòng)物陰道開(kāi)口時(shí)間延遲。雄性SD大鼠暴露于72.5 mg/kg的2,4-D可降低睪酮T的含量，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見(jiàn)高劑量2,4-D影響雄性大鼠T的合成與分泌，Zhang等[19]的研究也顯示2,4-D染毒(50、100、200 mg/kg，14 d)會(huì)降低血清中睪酮含量，血清中FSH和LH改變無(wú)明顯差異，結(jié)合Leydig細(xì)胞病理學(xué)改變(100、200 mg/kg)，他們認(rèn)為2,4-D對(duì)Leydig細(xì)胞直接影響干擾了睪酮合成和釋放，而本研究并沒(méi)有觀察到睪丸組織的異常病理變化，可能與本研究劑量不夠大有關(guān)，因此其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探究。此前有研究者已經(jīng)證實(shí)2,4-D(130 mg/kg)通過(guò)抑制膽固醇合成酶(Hmgcs1/Hmgcr)降低睪丸Leydig細(xì)胞中的膽固醇含量，導(dǎo)致睪丸減少，他們還觀察到2,4-D損害小鼠正常精子的形成是通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 α( P PARα)破壞Leydig細(xì)胞中的膽固醇/睪酮穩(wěn)態(tài)，因此認(rèn)為，長(zhǎng)期接觸2,4-D誘發(fā)的人類(lèi)睪丸毒性可能與PPARα有關(guān)[20]。這也與此前美國(guó)學(xué)者[11]對(duì)非洲爪蟾進(jìn)行的研究結(jié)果相似，他們認(rèn)為2,4-D抑制了成熟黃體酮的表達(dá)進(jìn)而阻斷了性激素的分泌，而通過(guò)Western blot分析和U0126抑制劑研究，他們得出2,4-D能刺激MAPK信號(hào)通路啟動(dòng)的結(jié)論。

此外，機(jī)體性激素的分泌受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)。FSH、LH是垂體細(xì)胞分泌的兩種激素，F(xiàn)SH的作用主要是促進(jìn)卵泡成熟、促進(jìn)精子形成；LH的主要作用是刺激卵巢分泌女性雌激素與刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌男性激素。但本試驗(yàn)由于所用的檢測(cè)方法所能檢測(cè)到的LH、FSH的最低限分別為0.1、0.4 U/L，而低于該限值則無(wú)法顯示具體數(shù)值，因此在實(shí)驗(yàn)中尚不能表明2,4-D可通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)性激素的分泌產(chǎn)生影響。而有關(guān)2,4-D是如何引起E2以及T含量變化的，還需做進(jìn)一步的研究。