周小青，文可欣，尹洪萍，楊謹(jǐn)如，朱勇飛，*

（1. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2. 杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310018)）

氟他胺(flutamide)是一種有效的選擇性非甾體雄激素受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，臨床中常用于前列腺癌的治療[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者常利用孕期暴露氟他胺誘導(dǎo)雄性子代大鼠尿道下裂作為研究模型[2]；有研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露氟他胺不僅可致雄性子代發(fā)育異常，也可致雌性子代動(dòng)物卵巢發(fā)育受損[3]，但氟他胺是否也可作為誘導(dǎo)雌性子代子宮發(fā)育異常的模型尚未見(jiàn)研究報(bào)道。氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)影響雌性、雄性配子以及胚胎的發(fā)育能力，其作用可以持續(xù)到孕后期[4]。已知氟他胺可以在體外誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞發(fā)生OS反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞受到損傷[5]，但尚未發(fā)現(xiàn)氟他胺是否也影響子宮、卵巢OS能力及相關(guān)基因的表達(dá)。本文擬對(duì)孕期暴露氟他胺所致雌性子鼠子宮和卵巢的發(fā)育異常及病理特征進(jìn)行觀察，同時(shí)檢測(cè)OS反應(yīng)相關(guān)酶、代謝物以及基因的表達(dá)。目的是進(jìn)一步確認(rèn)氟他胺對(duì)雌性子代生殖器官發(fā)育的影響，同時(shí)為進(jìn)一步研究其損傷機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑有：氟他胺(Sigma公司)，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司)，Trizol總RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific公司)。

主要儀器有：全自動(dòng)樣品快速研磨機(jī)(上海凈信科技)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司)，Veriti型RTPCR儀(Thermo Scientific公司)，7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (ABI公 司 )， MULTISKAN FC全 自 動(dòng) 酶 標(biāo) 儀(Thermo Scientific公司)。

1.2 動(dòng)物分組及染毒方法

取SPF級(jí)8周齡ICR雌鼠50只、雄鼠15只[湖南施萊克景達(dá)公司，許可證號(hào)SCXK(湘)2013-0004]，于室溫20~25℃、相對(duì)濕度40%~60%、循環(huán)光照為12/12 h 的飼養(yǎng)間中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，小鼠按雌雄比例2∶1 配對(duì)合籠，觀察到陰栓之日記為孕期(gestational day，GD)第0天(GD0)[6]。將40只自然受孕小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組20只，根據(jù)文獻(xiàn)[7]和本實(shí)驗(yàn)室既往研究數(shù)據(jù)[8]，在GD12~GD18連續(xù)7 d進(jìn)行300 mg/ (kg·d)氟他胺灌胃，對(duì)照組給予等體積的大豆油灌胃。

1.3 樣品收集與測(cè)量

于子鼠出生7周后觀察外形，頸椎脫臼處死，隨機(jī)選取40只子代雌鼠(每窩隨機(jī)選取1只)，稱體質(zhì)量，處死后立即取子宮、卵巢組織，去除周圍的脂肪、結(jié)締組織，用生理鹽水洗凈表面血污后用濾紙吸干，稱體質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)，小鼠臟器指數(shù)計(jì)算公式：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體 質(zhì)量，即每克體質(zhì)量相對(duì)應(yīng)的臟器質(zhì)量[8]。每組隨機(jī)取12只雌鼠按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)其子宮、卵巢中的MDA、SOD、GSH-Px；另外，兩組中各隨機(jī)取12只雌鼠的子宮和卵巢保存于-80 ℃冰箱。最后每組隨機(jī)選擇部分子鼠的子宮、卵巢組織置于10%甲醛溶液中固定。

1.4 組織病理檢測(cè)

取甲醛溶液中固定的子宮和卵巢組織，按常規(guī)方法經(jīng)組織脫水處理后用石蠟包埋，制作石蠟標(biāo)本，5 μm連續(xù)切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色法進(jìn)行常規(guī)染色處理，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病變情況。

1.5 小鼠卵泡計(jì)數(shù)

對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組切片中的原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)，各級(jí)卵泡以光學(xué)顯微鏡下看到卵母細(xì)胞核為計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)[9]。陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查法確定7周齡小鼠動(dòng)情周期，每組獲得2只動(dòng)情期子鼠，取其卵巢組織行5 μm連續(xù)切片，每隔3張切片取1片組織進(jìn)行觀察，每組共選5張，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，則每組小鼠卵巢各級(jí)卵泡數(shù)目為25個(gè)視野內(nèi)各級(jí)卵泡數(shù)目總和[10]。

1.6 蛋白濃度測(cè)定及OS指標(biāo)測(cè)定

分別剪碎子宮和卵巢組織，加入蛋白裂解液，用全自動(dòng)樣品快速研磨機(jī)研磨組織，在低溫冷凍離心機(jī)中以4 ℃、12 000 r/min離心15 min后取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，配制檢測(cè)液后使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組織中MDA、SOD、GSH-Px吸光度數(shù)值，根據(jù)試劑盒說(shuō)明按照蛋白濃度及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)的具體數(shù)值。

1.7 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)

將保存于-80 ℃ 冰箱中的樣品用Trizol裂解，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，溶于無(wú)核酸酶水中，取約1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。將所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(10 μL)如下：SYBER緩沖液2.5 μL、cDNA1 μL、上下游引物各0.3 μL、DEPC水5.9 μL。反應(yīng)條件為：95℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，循環(huán)40次。引物序列見(jiàn)表1。

通過(guò)各目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增曲線的 CT值 與所設(shè)內(nèi)參基因 β-actin的 CT值 相比較來(lái)進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別減去對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因 CT值 ，得到Δ CT， 對(duì)照 組差異倍數(shù)為實(shí)驗(yàn)組2-??CT值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 孕期氟他胺暴露致雌性子鼠體質(zhì)量、子宮和卵巢質(zhì)量的改變

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組雌性子鼠數(shù)量分別為101和97只，兩組外觀無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組雌性子鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量、子宮質(zhì)量較對(duì)照組低(P <0.05)，但子宮臟器系數(shù)與卵巢臟器系數(shù)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P >0.05)。見(jiàn)表2。

與對(duì)照組比較，*<0.05.P

2.2 子宮和卵巢病理學(xué)改變

結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組所有子代雌鼠的子宮和卵巢均出現(xiàn)了組織病理學(xué)改變。如圖1所示，對(duì)照組子宮內(nèi)腔淺皺襞狀，固有層淺層富含淋巴樣細(xì)胞，肌層內(nèi)環(huán)外縱，其間血管層間質(zhì)緊密(圖1A、1C)；實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)腔皺襞形成不明顯，固有層淋巴樣間質(zhì)細(xì)胞密度偏低，分布欠均勻，肌層平滑肌排列內(nèi)環(huán)外縱，其間血管層間質(zhì)疏松，境界分明(圖1B、1D)。觀察卵巢皮質(zhì)及部分髓質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組卵巢皮質(zhì)部可見(jiàn)多個(gè)不同發(fā)育階段的卵泡，早期為主，可見(jiàn)有次級(jí)或趨于成熟卵泡形成(圖1E)；實(shí)驗(yàn)組卵巢皮質(zhì)部可見(jiàn)較多處于早期發(fā)育階段的卵泡，未見(jiàn)成熟卵泡形成(圖1F)。

2.3 卵泡數(shù)量變化

對(duì)兩組子鼠卵巢按各級(jí)卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)(表 3)，實(shí)驗(yàn)組原始卵泡數(shù)量和成熟卵泡數(shù)量較對(duì)照組減少(P均<0.05)，而初級(jí)卵泡數(shù)量和次級(jí)卵泡數(shù)量與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 小鼠卵泡計(jì)數(shù)

2.4 子宮和卵巢氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)生化指標(biāo)的改變

氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 4。實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)SOD活性較對(duì)照組降低、GSH-Px含量下降而MDA水平上升(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組卵巢內(nèi)SOD活性較對(duì)照組降低(P<0.05)、GSH-Px含量下降(P<0.05)，而MDA水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 雌性子鼠子宮和卵巢形態(tài)學(xué)的比較

表4 孕期氟他胺暴露致雌性子鼠生殖器官氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的改變(n =12)

2.5 子代雌鼠氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的改變

如表5所示，子宮內(nèi)Noxo1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P<0.05)，Sod1表達(dá)水平較對(duì)照組降低(P<0.05)，而Gpx1表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組卵巢內(nèi)Noxo1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P<0.05)，Gpx1表達(dá)水平較對(duì)照組降低(P<0.05)，Sod1表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 實(shí) 驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠 氧 化應(yīng)激相 關(guān)基因 m RNA的 相對(duì)表達(dá)水平(n =12)

3 討 論

生殖和發(fā)育功能障礙是當(dāng)前嚴(yán)重影響人體健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。因此，環(huán)境因素，特別是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)生殖發(fā)育的影響及其機(jī)制，一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。揭示致畸機(jī)制首先需要一個(gè)良好的研究模型，但一直缺乏雌性生殖器官發(fā)育異常模型，這給機(jī)制研究造成了困難。近年來(lái)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露氟他胺不僅可致雄性子代尿道下裂等發(fā)育異常，也可致雌性動(dòng)物性腺等發(fā)育受影響[3]。但該研究受試動(dòng)物為豬[3，11]。我們?cè)谘芯糠穼?duì)小鼠雄性子代生殖器官發(fā)育異常時(shí)，發(fā)現(xiàn)雌性子代生殖器官發(fā)育也有異常[8]。對(duì)氟他胺是否也可誘導(dǎo)作為雌性子代生殖器官發(fā)育異常模型尚未見(jiàn)研究報(bào)道。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)觀察了300 mg/(kg·d)劑量氟他胺灌胃孕鼠對(duì)雌性子代生殖器官發(fā)育的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟他胺暴露組雌性子鼠體質(zhì)量降低，但子宮、卵巢臟器系數(shù)與對(duì)照組相比 差 異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)子宮和卵巢發(fā)育遲緩，原始卵泡和成熟卵泡數(shù)量均少于對(duì)照組，表明在宮內(nèi)暴露氟他胺條件下，可影響雌性子鼠子宮和卵巢的發(fā)育。組織病理學(xué)檢查還顯示，實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)腔皺襞形成不明顯，推測(cè)可能是由于氟他胺阻斷雄激素的作用，抑制蛻膜化應(yīng)答[12]，使宮腔內(nèi)皺襞形成不明顯。實(shí)驗(yàn)組卵巢中原始卵泡和成熟卵泡數(shù)量均較對(duì)照組少，提示氟他胺對(duì)雌鼠卵巢儲(chǔ)備功能以及卵泡發(fā)育有抑制作用，但尚需更深入的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。

氟他胺為非類固醇雄激素拮抗劑，在靶組織內(nèi)與雄激素競(jìng)爭(zhēng)同一受體，阻斷雙氫睪酮與雄激素受體結(jié)合，抑制靶組織攝取睪酮，從而起到抗雄激素的作用[13]。在雌性，睪酮除了作為合成雌激素的前體，在出生前還支持卵巢卵泡的發(fā)育[2]。因此，如果宮內(nèi)發(fā)育期間影響了睪酮水平以及與靶器官受體的結(jié)合，可能通過(guò)影響雌激素的合成和卵泡的發(fā)育。

氧化應(yīng)激(OS)是很多化學(xué)物導(dǎo)致發(fā)育毒性的重要機(jī)理之一，已知氟他胺可以在體外誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞發(fā)生OS反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞受到損傷[5]。氟他胺所致子鼠發(fā)育異常，除藥理作用的延伸外，是否還可由于氧化應(yīng)激引起，或兩種共同作用所致值得研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟他胺暴露組雌性子鼠子宮和卵巢中部分與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的生化指標(biāo)(GSH-Px、SOD、MDA)及基因(S od1 、 N oxo1 、 G px1 )的表達(dá)發(fā)生改變。 N oxo1基因能調(diào)控 N ox1 基因[14]及 N ox3 基因[15]的表達(dá)，在細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)[16]。本研究實(shí)驗(yàn)組子宮組織中Noxo1 mRNA的表達(dá)水平升高，提示細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加；GSH-Px活性降低，說(shuō)明子宮組織內(nèi)對(duì)過(guò)氧化物的分解能力可能下降；SOD的活性與Sod1表達(dá)水平較對(duì)照組降低，則反映子宮組織內(nèi)催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用的反應(yīng)減弱[17]；而脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝物MDA含量升高，與其他作者發(fā)現(xiàn)的氟他胺致大鼠肝細(xì)胞毒性的研究結(jié)果一致[5，18]。

在正常狀態(tài)下，卵泡內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生一定量的ROS，這些ROS有一定的生理功能，在卵泡發(fā)育、破裂排卵過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19]。適量的自由基也不會(huì)對(duì)機(jī)體造成有害影響，但是在暴露于某些內(nèi)源性因素(感染、高血壓、糖尿病等)和外源性因素(環(huán)境污染、重金屬、藥物、輻射等)時(shí)，產(chǎn)生過(guò)量的自由基會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子氧化損傷，引起細(xì)胞凋亡、壞死[20]。本研究實(shí)驗(yàn)組卵巢內(nèi)GSH-Px與Gpx1均較對(duì)照組降低，SOD活性較對(duì)照組降低，Noxo1表達(dá)水平升高，我們推測(cè)氟他胺可能抑制GSH-Px與SOD的活性，導(dǎo)致ROS大量生成，從而對(duì)卵巢組織造成損傷。

綜上所述，用300 mg/(kg·d)氟他胺灌胃孕鼠可致雌性子鼠子宮和卵巢損傷，并對(duì)其抗氧化應(yīng)激能力造成一定的影響。子鼠子宮和卵巢的損傷機(jī)制到底是由于氟他胺影響睪酮水平、競(jìng)爭(zhēng)靶器官受體，還是由于氟他胺抑制其抗氧化應(yīng)激能力而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死，有待我們進(jìn)一步研究。