曹 玥，孫夢云，蔡靜明，張立加，趙 艷*

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081）

microRNA作為一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要參與者和調(diào)節(jié)者[1-3]。近年來發(fā)現(xiàn)，microRNA可參與脂代謝，從而調(diào)節(jié)非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)生發(fā)展[4-5]。NAFLD被認為是與胰島素抵抗、肥胖和血脂異常等密切相關(guān)的一種臨床病理綜合征，但其發(fā)病機制尚未完全闡明[6-8]。

miR-34a參與多種病理生理過程，如脂肪酸氧化和合成，脂肪和膽固醇代謝以及細胞凋亡等。研究顯示，miR-34a可能與NAFLD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[9]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的組蛋白去乙酰化酶，已被證實為miR-34a的靶基因之一，也是miR-34a特征性的直接作用靶點[10]。SIRT1可改善外周胰島素抵抗、調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、改善氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙和減弱炎癥反應(yīng)等，從而在改善NAFLD肝臟病變中起著重要作用[11]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-34a 在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用，但在鐵超載大鼠NAFLD發(fā)生中的作用尚不清楚。本研究在高脂飲食誘導(dǎo)大鼠建立NAFLD模型的基礎(chǔ)上，給予高鐵飲食干預(yù)，觀察miR-34a及其下游基因在大鼠肝臟中的表達情況，進一步探討NAFLD的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

5周齡清潔級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量150 g左右，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)測定試劑盒購于日本W(wǎng)ako公司；SIRT1兔單克隆抗體購于美國Cell Signaling公司 ； 過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α， PPARα)兔多克隆抗體購于英國Abcam公司 ； β-actin兔多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司； 辣根過氧化物酶標記的二抗購于中杉金橋公司；miRNeasy Mini試劑盒購于QIAGEN公司 ； 引物購于上海捷瑞生物工程有限公司 ； High Capacity cDNA RT和POWER SYBR GREEN購于Applied Biosystem公司。

1.2 主要儀器

全自動生化分析儀，中國日立有限公司；組織勻漿器，美國MP BIO公司；FluorChem E數(shù)字成像儀，美國Protein Simple公司；核酸測定儀，Gene Company Limited公司；實時熒光定量PCR儀，美國ABI 7500 Fast。

1.3 動物飼料

動物飼料為合成飼料?；A(chǔ)飼料參考Research Diets D12450H飼料配方，脂肪供能比為10%；高脂飼料參考Research Diets D12451飼料配方，脂肪供能比為35%；高鐵飼料是在基礎(chǔ)飼料中添加1%硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)；高脂高鐵飼料是在高脂飼料中添加1%硫酸亞鐵(FeSO4· 7H2O)。高脂飼料成分包括：酪蛋白(200 g/kg)、L-胱氨酸(3 g/kg)、玉米淀粉(72.8 g/kg)、麥芽糖糊精(100 g/kg)、蔗糖(172.8 g/kg)、纖維素(50 g/kg)、豆油(50 g/kg)、豬油(177.5 g/kg)、礦物質(zhì)混合物(10 g/kg)、磷酸二鈣(13 g/kg)、磷酸鈣(5.5 g/kg)、檸檬酸鉀(16.5 g/kg)、維生素混合物(10 g/kg)、豬膽鹽(4 g/kg)、膽固醇(1.3 g/kg)。

1.4 實驗動物分組及方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按大鼠體質(zhì)量隨機分為：空白對照組(基礎(chǔ)飼料)、高鐵組(含1% FeSO4的基礎(chǔ)飼料)、高脂組(脂肪供能比為35%的高脂飼料)、高脂高鐵組(含1% FeSO4的高脂飼料)，每組9只。每周稱量大鼠體質(zhì)量，12周末剔除肥胖抵抗大鼠4只，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血。摘取肝臟，稱取質(zhì)量后部分肝組織于4%多聚甲醛溶液中固定保存，剩余部分于液氮中冷凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.5 大鼠肝臟油紅O染色

采用肝臟油紅O染色觀察大鼠肝臟中脂質(zhì)堆積程度。分別取各組用4%多聚甲醛溶液固定好的肝臟約50 mg，并用10%、20%和30%的蔗糖溶液進行梯度脫水，切片約10 μm，油紅O染色10 min，經(jīng)60%異丙醇分化后，雙蒸水洗滌1~2 min，蘇木精復(fù)染1 min，甘油明膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 血清ALT、AST含量測定

取實驗大鼠血清300 μL于全自動生化分析儀檢測大鼠血清中ALT和AST的水平。

1.7 實時熒光定量PCR檢測miR-34a及其下游基因的表達

分別取每只大鼠新鮮冰凍肝組織25 mg，使用miRNeasy Mini試劑盒提取總RNA，測定RNA純度及濃度后，根據(jù)High Capacity cDNA RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA為模板，使用POWER SYBR GREEN試劑盒，進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)。反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s(40個循環(huán))，分別采用 U 6 和 β-actin為 內(nèi)參照基因進行校準。用2-△△CT法計算目的基因的表達量，△△ CT=(CT， 實驗組目的基因- CT，實驗組內(nèi)參) -(CT，對照組目的基因- CT，對照組內(nèi)參)。相關(guān)引物序列見表1。

表1 實 時熒光定量 P CR引物序列

1.8 Western blot法檢測miR-34a下游SIRT1和PPARα蛋白的表達

稱取100 m g冰凍的大鼠肝組織，使用組織勻漿器充分勻漿，用強效裂解液在冰上裂解1 h后，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品加入上樣緩沖液，加熱變性后等量上樣，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，4 ℃轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，加入SIRT1、PPAR α、 β -actin一抗4 ℃過夜，用TBST漂洗3次。加入二抗，室溫孵育1 h，TBST中漂洗3次。ECL法顯色，數(shù)字成像儀拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 高脂高鐵飲食對大鼠體質(zhì)量的影響

實驗開始時各組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異，12周時高脂組和高脂高鐵組大鼠體質(zhì)量均明顯高于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 高脂高鐵飲食對大鼠體質(zhì)量的影響

2.2 大鼠肝臟油紅O染色結(jié)果

大鼠肝臟油紅O染色結(jié)果顯示，與對照組相比，高脂組與高脂高鐵組肝臟內(nèi)紅色脂滴的數(shù)量明顯增加且體積增大，高脂高鐵組脂滴體積大于高脂組。見圖2。

圖2 高 脂高鐵飲食對大鼠肝臟的影響(油紅 O 染 色，×200)

2.3 高脂高鐵飲食對大鼠肝功能酶的影響

大鼠血清ALT和AST檢測結(jié)果顯示，高脂組和高脂高鐵組大鼠血清ALT含量明顯高于對照組(P<0.05)，而血清AST含量在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

與對照組相比，*<0.05.P

2.4 高脂高鐵飲食對大鼠肝臟miR-34a表達的影響

qPCR檢測miR-34a的表達結(jié)果顯示，高脂組和高脂高鐵組大鼠肝臟中miR-34a表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。見圖4。

2.5 高脂高鐵飲食對大鼠肝臟SIRT1和PPARα表達的影響

與對照組相比，高鐵組、高脂組和高脂高鐵組大鼠肝臟中SIRT1 mRNA及蛋白表達均顯著降低(P均<0.05)；與高脂組相比，高脂高鐵組大鼠肝臟中SIRT1的mRNA及蛋白表達水平也明顯降低(P均<0.05)。見圖5A和5B。

與對照組相比，高脂高鐵組大鼠肝臟中PPARα mRNA和蛋白表達均明顯降低(P均<0.05)， 高脂組僅PPARα蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與高脂組相比，高脂高鐵組大鼠肝臟中PPARα mRNA及蛋白表達水平均明顯降低( P 均<0.05)。見圖5C和5D。

3 討 論

NAFLD的顯著特征是脂肪在肝細胞內(nèi)過度沉積[12-14]。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)SD大鼠建立NAFLD動物模型，在12周的干預(yù)期內(nèi)，大鼠體質(zhì)量明顯增加，肝組織內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增多，體積明顯增大，表明NAFLD大鼠模型成功建立，而且高脂高鐵聯(lián)合作用后，出現(xiàn)了更為明顯的脂質(zhì)堆積，表明鐵超載加重了肝臟脂質(zhì)沉積。

ALT與AST均為非特異性細胞內(nèi)功能酶，主要分布于肝細胞內(nèi)，當(dāng)肝細胞受損時，其內(nèi)所含ALT和AST釋放入血，引起血液中ALT和AST濃度升高。為觀察高脂高鐵膳食對大鼠肝臟功能的影響，我們對大鼠血清ALT和AST含量進行檢測。結(jié)果顯示，高脂組和高脂高鐵組大鼠血清ALT含量明顯高于對照組。由此說明，隨著干預(yù)時間延長，單純高脂和高脂高鐵膳食對大鼠肝功能的損傷加重。

研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者的肝組織中miR-34a的表達顯著上升[15]。 Shan等[16]發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟中miR-34a表達也上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，高脂組和高脂高鐵聯(lián)合組大鼠肝組織中miR-34a 的表達水平較對照組均顯著上調(diào)，與上述結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)，高脂和高脂高鐵飲食可抑制大鼠肝臟SIRT1的表達。SIRT1作為miR-34a特征性靶點，在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用，并且miR-34a上調(diào)會抑制SIRT1的表達[17-18]。SIRT1下游的靶基因PPARα對于促進脂肪酸 β氧化，加速脂肪酸分解，以及減少氧化應(yīng)激和抑制炎癥反應(yīng)起到關(guān)鍵作用[19-21]。本研究顯示，在高脂組和高脂高鐵聯(lián)合組大鼠肝組織中，SIRT1表達下調(diào)會抑制下游靶基因 P PARα的表達，并且高脂高鐵組與高脂組相比下降更明顯。與高糖高脂飲食可下調(diào)非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)大鼠肝臟PPAR α的表達，從而增加脂質(zhì)蓄積和氧化應(yīng)激的結(jié)果一致[22]。

A：SIRT1 mRNA水平；B：SIRT1蛋白表達水平；C：PPARα mRNA水平；D：PPARα蛋白表達水平. 與對照組相比，*P<0.05；與高脂組相比，#P<0.05.

本研究結(jié)果提示，激活miR-34a及其下游基因的表達，可能是導(dǎo)致NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，過量脂質(zhì)在肝臟沉積的重要因素。高脂高鐵聯(lián)合作用后，miR-34a及其下游基因表達水平變化更為顯著，肝臟脂肪堆積及損傷程度也更嚴重，表明高脂高鐵聯(lián)合作用可能進一步激活了miR-34a表達，進而抑制了其下游基因的表達，因此加重了NAFLD大鼠肝臟脂肪變性的程度。

綜上所述，高脂飲食能夠成功誘導(dǎo)大鼠NAFLD模型，鐵超載可進一步改變大鼠脂質(zhì)代謝過程，激活miR-34a表達，進而抑制其下游基因的表達，從而加重脂代謝紊亂，造成肝臟內(nèi)脂質(zhì)累積，并使肝臟損傷程度加重，促進NAFLD的發(fā)生發(fā)展，但其機制還有待于進一步研究和證實。