黃壯程，王宏浩，沈沛麟，林明恩，何學(xué)軍*

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東汕頭 515041）

泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤是膀胱癌，在常發(fā)惡性腫瘤中居第10位，其中超過90%是膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cell carcinoma，BUC)。膀胱癌首選手術(shù)治療聯(lián)合術(shù)后膀胱灌注治療，由于膀胱癌具有時(shí)間上反復(fù)發(fā)作和空間上多中心性的特點(diǎn)，50%~70%的膀胱癌患者，經(jīng)治療后5年內(nèi)復(fù)發(fā)，并較首發(fā)時(shí)惡性程度更高[1]。因此，迫切需要從根本上了解膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，為膀胱癌診斷、靶向治療及預(yù)后監(jiān)測提供新方法。

腺性膀胱炎(cystitis glandularis，CG)于1887年由Von Limbberk首次報(bào)道，是一種膀胱黏膜增殖性、化生性病變，其病因至今尚未完全明確，多認(rèn)為與慢性刺激黏膜上皮使其化生為腺性上皮相關(guān)[2-3]。目前有認(rèn)為CG是正常的生理現(xiàn)象，主張保守治療，也有認(rèn)為CG是癌前病變，建議積極處理[3]。在CG與膀胱腫瘤的關(guān)系尚無定論的情況下，如何治療CG存在較大爭議。

Notch信號通路廣泛存在于各種動物細(xì)胞的生物學(xué)行為中，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和死亡等多個過程，對組織、器官的分化和發(fā)育具有重要作用。當(dāng)Notch信號通路異常激活時(shí)，細(xì)胞分化異常并可能形成腫瘤[4]。Notch1是該通路的重要受體，Hes1是通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過分析其表達(dá)，可間接反映Notch信號通路的強(qiáng)弱。

本研究采用免疫組織化學(xué)(SABC法)技術(shù)分別檢測正常膀胱組織、CG和膀胱癌組織中Notch1、Hes1的表達(dá)，以探討其在CG形成和腫瘤發(fā)展中的作用及意義，并嘗試探討CG與膀胱癌發(fā)生的關(guān)系，擬為CG以及膀胱癌的預(yù)測、診斷、治療、預(yù)后、復(fù)發(fā)監(jiān)測提供臨床新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

標(biāo)本收集自2016—2017年汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，由臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的泌尿外科醫(yī)師主刀，50例膀胱癌標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理確診，其中男39例，女11例；按WHO 2004膀胱癌組織病理學(xué)分為：低級別乳頭狀尿路上皮癌15例；高級別乳頭狀尿路上皮癌35例。全部病例術(shù)前均無放、化療。收集經(jīng)術(shù)后病理確診的CG組織26例，其中女性21例，男性5例；年齡36～75歲。對照組為16例膀胱正常組織，術(shù)前均經(jīng)患者或家屬同意。所有標(biāo)本均由本院病理科醫(yī)師復(fù)核。

1.2 主要試劑

兔抗人Notch1單克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Hes1單克隆抗體購自美國Abcam公司，DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液均購自博士德生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)步驟 免疫組化采用SABC法。所有組織均經(jīng)4%多聚甲醛固定、常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、4 μm切片，用于HE染色和免疫組化染色。按照SABC法試劑盒說明書操作，DAB顯色后封片，顯微鏡拍照。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 結(jié)果判斷 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用半定量積分法分析[5]，隨機(jī)觀察5個400倍視野，觀察染色質(zhì)的染色深度并計(jì)算著色細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算評定結(jié)果，見表1。

*由陽性細(xì)胞和染色強(qiáng)度記分相乘所得.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0處理，采用 χ2檢驗(yàn)分析兩組間計(jì)數(shù)資料，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Notch1和Hes1在CG和BUC組織中的表達(dá)

Notch1和Hes1在BUC、CG組織和膀胱正常組織中均有陽性表達(dá)。分析結(jié)果顯示，Notch1和Hes1在正常膀胱組織中大部分為陰性表達(dá)(評定結(jié)果計(jì)分為0~1分)，Notch1陽性表達(dá)率為25%(4/16)，Hes1為18.75%(3/13)。在BUC組中，Notch1和Hes1表達(dá)從陰性到強(qiáng)陽性不等，主要位于胞質(zhì)及胞核，評定結(jié)果計(jì)分為0~8 分 ， Notch1陽 性 表 達(dá) 率 為70%(30/50)，Hes1為76%(38/50)。而在CG組中，兩者表達(dá)結(jié)果計(jì)分均為0~4 分 ，其中Notch1陽性表達(dá)率為65.38%(17/26)，見圖1。BUC和CG組中Notch1、Hes1蛋白表達(dá)均較正常膀胱組織高，見表2，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CG組和BUC組中兩者之間表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Notch1和Hes1在CG和BUC的表達(dá)中，隨著膀胱細(xì)胞異質(zhì)性愈明顯，其陽性率愈高。

表2 Notch1和Hes1 在 正常膀胱組織、C G 及 B UC 組織中表達(dá)情況

2.2 Notch1和Hes1在BUC組織中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

Notch1和Hes1表達(dá)強(qiáng)度均隨BUC病理分級升高而升高，染色強(qiáng)度亦加深(P<0.05)。且Notch1隨著BUC患者年齡增高陽性表達(dá)率升高(P<0.05)，性別對于Notch1和Hes1在CG和BUC組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

圖1 Notch1和 Hes1 在 正常膀胱組織、 C G 及 BUC組 織中的表達(dá)情況(× 4 00)

表3 CG及 B UC 中 N otch1和H es1表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

3 討 論

人Notch受體家族包括 N otch1~4共4個成員，配體至今發(fā)現(xiàn)有5種：Jagged 1、Jagged 2(Serrate的同系物)、Delta 1、Delta 3和Delta 4(Delta的同系物)。經(jīng)典的Notch信號通路的激活是Notch配體與受體結(jié)合后開始，生成激活形式即胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，NICD)，與細(xì)胞核中DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后激活下游靶基因如 H es基 因[6]。在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中，Notch通路可表現(xiàn)為抑制或激活狀態(tài)，從而起到抑癌或促癌作用。

3.1 Notch1與腺性膀胱炎及膀胱癌的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在CG、BUC組織中均有陽性表達(dá)，且表達(dá)較對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義，而CG組與 B UC組織之間表達(dá)無顯著差異，提示CG與BUC可 能存在相關(guān)性。在 B UC中 ，Notch1隨著 B UC病理分級的升高而表達(dá)增加，提示Notch1與 B UC侵襲性和轉(zhuǎn)移可能相關(guān)，Notch1異常激活導(dǎo)致 B UC侵襲力增加。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，Notch1的異?；罨霈F(xiàn)在10%~15%的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，是第 2常見的突變基因[7]。在膀胱癌中，已有研究[8]表明在高級別膀胱癌中Notch1呈高表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)類似?？梢奛otch1的異?；罨３Ｅc腫瘤的發(fā)生相關(guān)，在CG中也可見Notch1的活化，提示CG亦有類似腫瘤的生物學(xué)行為。

3.2 Hes1與腺性膀胱炎及膀胱癌的關(guān)系

Hes1是Notch途徑的重要組成成員，主要調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生理過程及表觀遺傳，包括細(xì)胞分化、周期調(diào)控及細(xì)胞更新能力，常發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，Hes1在正常膀胱組織、膀胱癌組織及CG組織中均存在陽性表達(dá)，且與正常膀胱組織間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CG與膀胱癌組織中Hes1陽性表達(dá)無顯著差異，提示CG與膀胱癌存在相關(guān)性。在鼻咽癌中，Hes1通過下調(diào)腫瘤抑制因子(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)，促發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)驅(qū)動，促進(jìn)鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。因此我們推測，Hes1作為Notch信號通路的下游靶向因子，在Notch信號通路調(diào)節(jié)下，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，其傳遞Notch信號，促使正常膀胱細(xì)胞發(fā)生腺上皮化生，維持膀胱腫瘤細(xì)胞的未分化狀態(tài)，使其處于增殖狀態(tài)，并可能介導(dǎo)CG癌變。

3.3 Notch信號通路與腺性膀胱炎及膀胱癌關(guān)系

1958年Shaw等首次報(bào)道了1例CG患者經(jīng)過5年轉(zhuǎn)變?yōu)橄侔┖?，關(guān)于CG與膀胱腫瘤的研究越來越多。CG與癌變的關(guān)系目前還未肯定。有學(xué)者認(rèn)為它是一種癌前病變。有實(shí)驗(yàn)[10]證明，CG和膀胱癌組織中的CCND1、 C CNA1、 EGFR、 AR、 C X3CL1、 C XCL6、CXCL1等促癌基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組；姚友生等[11]通過觀察分析458例女性CG患者，其中2例CG患者出現(xiàn)腺癌改變。從危險(xiǎn)因素上看，CG與膀胱癌均與長期慢性刺激相關(guān)，CG有發(fā)展成癌的可能。目前來看CG為一種良性病變，但其與膀胱癌相關(guān)，而且膀胱腺癌惡性度高、早轉(zhuǎn)移 、 復(fù)發(fā)率高，因此進(jìn)一步確認(rèn)CG與膀胱癌之間的關(guān)系，并嘗試提出診斷及治療CG新方案，對CG的診治有重要的臨床意義。

近年來，越來越多的研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲過程中起到關(guān)鍵作用。EMT可促使癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。研究表明，Notch信號通路可通過上調(diào) C DH1基因(編碼E-鈣黏著蛋白)的轉(zhuǎn)錄抑制因子：SNAI1和SNAI2，從而驅(qū)動EMT。在乳腺癌中，Notch信號通路的激活通過上調(diào)SNAI2誘導(dǎo)EMT[12]。膀胱癌中已有研究發(fā)現(xiàn)Hes1的活性降低時(shí)，EMT效應(yīng)被抑制。因此我們推斷，在CG患者中，由于Notch信號通路的異?；罨?，激活下游靶基因 H es1，通過下調(diào)PTEN或驅(qū)動EMT等途徑，導(dǎo)致正常膀胱上皮化生，形成Brunn巢，接著巢中心腺樣化生，形成腺性膀胱炎，在異常活化的Notch信號通路作用下，病變的細(xì)胞無法自行修復(fù)，對后期CG進(jìn)展為膀胱癌起到關(guān)鍵作用；而在膀胱癌患者中，Notch信號通路的異常激活，不僅維持膀胱癌變細(xì)胞存在，使得細(xì)胞凋亡能力下降，同時(shí)通過增加實(shí)體腫瘤內(nèi)新生血管形成，增加血運(yùn)，在腫瘤的發(fā)展、侵襲與浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Notch1和Hes1在正常組織存在表達(dá)，而在膀胱癌和CG組織中存在高表達(dá)，且隨著病理分級升高，Notch1和Hes1表達(dá)亦增高(P<0.05)，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，Notch1和Hes1的陽性表達(dá)隨著膀胱細(xì)胞異質(zhì)性的明顯而升高。這些結(jié)果表明，Notch信號通路在CG和膀胱癌發(fā)生、發(fā)展存在并密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為CG為癌前病變，需要積極處理，我們推測，Notch信號通路在CG發(fā)展為膀胱癌過程中起到一定作用，因此我們建議可在CG患者中監(jiān)測Notch信號通路關(guān)鍵因子水平，作為CG診斷及選擇治療方案指標(biāo)之一。在膀胱癌患者中，我們通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)Notch1和Hes1的高表達(dá)，其可能作為早期監(jiān)測膀胱癌復(fù)發(fā)的指標(biāo)之一。Notch信號通路常與惡性腫瘤預(yù)后不良相關(guān)，因此，Notch1及Hes1可能作為膀胱癌的預(yù)后指標(biāo)。

綜上，CG的病因尚未完全明確，其與膀胱癌之間是否存在相關(guān)尚無定論，若能明確CG與膀胱癌之間的關(guān)系，可能為CG診治提供思路。通過本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Notch1和Hes1可作為CG及膀胱癌早期診斷的敏感指標(biāo)，對于臨床病理診斷CG并且Notch信號通路異常激活者，建議予以手術(shù)治療，并考慮給予膀胱灌注化療及規(guī)律隨訪。對于膀胱癌患者，Notch信號通路與其發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為其診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測、預(yù)后評估的指標(biāo)之一。