賀薈靜，劉金成，劉芡芡，王 云，*

（1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，山東 青島266021；2. 山東省萊鋼醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東萊蕪 271126）

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是在中國(guó)南方高發(fā)的一種頭頸部腫瘤，其發(fā)生與EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染密切相關(guān)，但EBV致癌機(jī)制尚不明確[1]。EBV編碼小RNA(EBV-encoded small RNAs， EBERs)為 非 編 碼 RNA， 包 括 EBER1和EBER2，是所有EBV感染類型中表達(dá)豐度最高的mRNA，其致癌作用已在多種細(xì)胞系中得到證實(shí)，因此EBERs在NPC及其他EBV相關(guān)腫瘤中可能發(fā)揮重要作用[2-3]。我們前期對(duì)EBV相關(guān)腫瘤中 EBV基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)了可能與NPC相關(guān)的 EBERs基因變異型EB-8m，該變異型在 EBER2基因轉(zhuǎn)錄區(qū)出現(xiàn)6處共有突變[4]，進(jìn)一步的功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)變異型EBER2可促進(jìn)NPC細(xì)胞系增殖，并對(duì) α-干擾素(interferon-α， IFN-α)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抵抗作用[5]。以往有研究表明EBERs可通過與RNA激活蛋白激酶(RNA-activated protein kinase，PKR)結(jié)合并抑制其激活從而增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡能力[6-9]。PKR是絲氨酸/蘇氨酸激酶，可被IFN或雙鏈RNA激活發(fā)生磷酸化，是IFN抗病毒作用中的效應(yīng)因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡中也具有調(diào)控作用，多數(shù)研究認(rèn)為PKR激活后可誘導(dǎo)翻譯起始因子eIF2α磷酸化從而抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮抑癌基因的作用[10-11]。EBER1和EBER2均可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并通過莖環(huán)與包括PKR在內(nèi)的幾種細(xì)胞蛋白結(jié)合[2，12]。由于EB-8m變異型在EBER2的6處突變有5處位于莖環(huán)內(nèi)[4，13]，因此本研究在以往實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)EB-8m變異型EBER2對(duì)NPC細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)其對(duì)PKR結(jié)合和磷酸化以及相關(guān)因子磷酸化和蛋白表達(dá)的影響，探討變異型EBER2增強(qiáng)NPC細(xì)胞抗凋亡作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

EBV陰性NPC細(xì)胞系HONE1和CNE1由廣東醫(yī)學(xué)院病理科朱偉教授饋贈(zèng)； EBER2基因慢病毒表達(dá)載體由上海吉瑪生物制藥有限公司構(gòu)建；真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3.1-PKR-FLAG由上海邁浦生物科技有限公司構(gòu)建。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑Annexin V-APC和 7-氨基-放線菌素D(7-amino-actinomycin D， 7 -AAD)分別購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司和美國(guó)BD公司；RNA蛋白結(jié)合免疫共沉淀試劑盒Magna RIPTM RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；Real-time PCR試劑盒購(gòu)于德國(guó)Roche公司；Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、 β-actin單克隆抗體和二抗購(gòu)于武漢博士德公司；PKR、eIF2α、c-Jun及磷酸化PKR(phosphorylated PKR，P-PKR)、P-eIF2 α、P-c-Jun多克隆抗體，F(xiàn)lag-Tag單克隆抗體和Bcl-2單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)ImmunoWay公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；Trizol RNA提取試劑購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；Active人類IFN-α全長(zhǎng)蛋白質(zhì)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

Roche Light Cycler 96型Real-time PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Roche公司；FUSION FX7顯影儀購(gòu)自法國(guó)VILBER公司；電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 EBER2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建

含 EBER2原型和變異型基因的慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選的步驟見參考文獻(xiàn)[5]，EBER2-B95-8、EBER2-8m和對(duì)照分別表示含原型EBER2基 因、變異型E BER2基因以及只含載體的細(xì)胞。

1.3 凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

分別對(duì)上述含有兩種 EBER2基因的HONE1和CNE1細(xì)胞以及只含載體的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行IFN-α和順鉑凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并且將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為6×104/mL，鋪6孔板，CO體積分?jǐn)?shù)為2 5%、37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，IFN-α誘導(dǎo)時(shí)加入濃度10 000 IU/mL的IFN-α作用72 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡；順鉑誘導(dǎo)時(shí)加入2 μg/mL順鉑分別作用24和48 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡。采用Annexin V-APC和7-AAD雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取3次試驗(yàn)均值。

1.4 蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot檢測(cè) EBER2基因轉(zhuǎn)染HONE1和CNE1細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞中各種蛋白的表達(dá)情況。將10 0 00 IU/mL的IFN-α加入EBER2-B95-8、EBER2-8m和對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液中作用24 h后，收集各組細(xì)胞，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取50 μ g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1~2 h后與一抗(1∶1 000稀釋) 4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫反應(yīng)2 h，再用TBST洗膜3次，最后用發(fā)光試劑ECL(A液和B液)進(jìn)行顯色，暗室曝光并保存圖片。Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，取3次實(shí)驗(yàn)均值。

1.5 RNA蛋白結(jié)合免疫共沉淀

對(duì)含有兩種 EBER2基因的HONE1和CNE1細(xì)胞進(jìn)行RNA和PKR蛋白結(jié)合免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。首先制備PKR真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3.1-PKR-FLAG。人PKR基因的GenBank序列號(hào)為M85294，cDNA全長(zhǎng)1 656 bp。PKR cDNA序列前連接FLAG短肽標(biāo)簽(DYKDD DDK)編碼序列(GATTACAAGGATGACGACGATAAG)，然后克隆至pcDNA3.1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 D H5α，通過氨芐青霉素抗性、PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定，選擇PKR序列完全正確的陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞融合至90%時(shí)，用Lipofectamine 2000將質(zhì)粒pcDNA3.1-PKR-FLAG分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EBER2-B95-8和EBER2-8m細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物，吸取1/10細(xì)胞裂解產(chǎn)物作為“input”，-80 ℃儲(chǔ)存直至RNA純化，剩余細(xì)胞裂解產(chǎn)物與以anti-FLAG抗體制備的免疫沉淀磁珠混合進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，陰性對(duì)照為試劑盒提供的IgG抗體免疫磁珠。取免疫共沉淀產(chǎn)物，分別提取純化RNA和蛋白，用于EBER2 RNA和PKR蛋白檢測(cè)。免疫共沉淀反應(yīng)、RNA純化和蛋白提取的步驟詳見RNA蛋白結(jié)合免疫共沉淀試劑盒說明書。

采用Real-time PCR檢測(cè)EBER2 RNA，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見文獻(xiàn)[5]。對(duì)提取純化的“input”和免疫共沉淀產(chǎn)物中的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，參照試劑盒說明書進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，以3%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增條帶。參照免疫共沉淀試劑盒說明書，計(jì)算免疫共沉淀產(chǎn)物中EBER2的富集倍數(shù)：用input的 CT值 對(duì)實(shí)驗(yàn)組和IgG組的 CT值 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，?CT，normalized= CT- [CT，input- log2(input稀釋因子)]，由于Realtime PCR的“input”為免疫共沉淀細(xì)胞溶解產(chǎn)物量的10%， 所 以input稀 釋 因 子 為10； 實(shí) 驗(yàn) 組 ? ?CT=?CT，normalizedtested- Δ CT，normalizedIgG， 實(shí)驗(yàn)組目的RNA的富集倍數(shù)為2-ΔΔCT，取3次 試 驗(yàn)均值。分別以PKR多克隆抗體和Flag-Tag單克隆抗體作為一抗，采用Western blot檢測(cè)免疫共沉淀產(chǎn)物中攜帶FLAG的PKR蛋白。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，EBER2-B95-8組和EBER2-8m組免疫共沉淀產(chǎn)物中EBER2富集倍數(shù)間差異的分析采用t檢驗(yàn)，EBER2-B95-8組、EBER2-8m組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率間和蛋白表達(dá)量間差異的分析采用完全隨機(jī)資料方差分析及q檢 驗(yàn)。以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖 1。IFN-α誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，兩種細(xì)胞系EBER2-B95-8組和EBER2-8m組細(xì)胞凋亡率均低于 對(duì) 照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且EBER2-8m組細(xì)胞凋亡率低于EBER2-B95-8組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。順鉑凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，在誘導(dǎo)后的24和48 h，兩種細(xì)胞系EBER2-B95-8組和EBER2-8m組細(xì)胞凋亡率均低于 對(duì) 照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且EBER2-8m組細(xì)胞凋亡率低于EBER2-B95-8組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 EBER2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PKR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

EBER2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PKR和相關(guān)因子磷酸化及蛋白表達(dá)情況見圖2。與 對(duì) 照組細(xì)胞比較，EBER2-B95-8和EBER2-8m組細(xì)胞中總PKR、eIF2α和c-Jun表達(dá)水平無明顯差異，但P-PKR、P-eIF2α和P-c-Jun表達(dá)減少，Bcl-2表達(dá)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或 P<0.01)。變異型基因和野生型基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，HONE1細(xì)胞中，P-PKR和P-eIF2α在EBER2-8m組的水平低于EBER2-B95-8組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， P-c-Jun和 Bcl-2的 表 達(dá) 尚 無 明 顯 差 異 (圖2A和B)；CNE1細(xì)胞中P-PKR在EBER2-8m組的水平低于EBER2-B95-8組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他蛋白的表達(dá)無明顯差異。

2.3 免疫共沉淀產(chǎn)物中EBER2 RNA和PKR蛋白檢測(cè)結(jié)果

Real-time PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3A，“input”組和anti-FLAG免疫共沉淀產(chǎn)物可觀察到EBER2擴(kuò)增條帶，IgG組未觀察到EBER2擴(kuò)增條帶。CNE1和HONE1細(xì)胞中，EBER2-8m組免疫共沉淀產(chǎn)物中EBER2的富集倍數(shù)(2-??CT)高于EBER2-B95-8組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3B)。以FLAG抗體和PKR抗體作為一抗，通過Western blot均可在anti-FLAG免疫共沉淀產(chǎn)物中檢測(cè)到FLAG-PKR蛋白，IgG組未檢測(cè)到FLAG-PKR蛋白(圖3C)。

圖3 PKR免 疫共沉淀產(chǎn)物中 EBER2 RNA 和 PKR蛋白檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

EBERs 是近年來得到認(rèn)可的EBV致癌基因，本研究順鉑和IFN-α凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示野生型和變異型EBER2均可增強(qiáng)NPC細(xì)胞的抗凋亡能力。以往實(shí)驗(yàn)也表明EBERs在腫瘤細(xì)胞系中可以抵抗多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，如IFN-α、Fas、低氧、放線菌酮和糖皮質(zhì)激素等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6-9，14]。PKR是一種各組織細(xì)胞廣泛表達(dá)的雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶，正常情況下處于無活性狀態(tài)，當(dāng)與雙鏈RNA結(jié)合后，PKR構(gòu)象發(fā)生變化，通過自身及相互磷酸化激活，作用于下游因子eIF2α、 NF-κB或絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)等調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡或生長(zhǎng)[11，15-17]。EBERs屬非編碼RNA，可與細(xì)胞雙鏈RNA識(shí)別因子相互作用[2-3，12]，EBERs與PKR的結(jié)合能抑制其發(fā)生磷酸化進(jìn)而失活。有研究在B淋巴瘤細(xì)胞系BJAB[6]、 鼻咽上皮細(xì)胞NP69[7]、 BL細(xì)胞系A(chǔ)kata[8]以及腸上皮細(xì)胞407[9]中均發(fā)現(xiàn)EBERs可通過結(jié)合PKR抑制其發(fā)生磷酸化從而增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡能力。以往研究均采用包括EBER1和EBER2在內(nèi)的完整EBERs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本研究結(jié)果顯示獨(dú)立的EBER2對(duì)抑制NPC細(xì)胞凋亡及PKR激活均具有與完整EBERs類似的作用，提示了EBER2功能的重要性，以往基因敲除實(shí)驗(yàn)表明EBER2是引起B(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因[18-19]。

EBER1或EBER2通過形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞蛋白結(jié)合[2，12-13]，EBERs二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于其發(fā)揮功能至關(guān)重要，誘導(dǎo)突變實(shí)驗(yàn)表明EBER1莖環(huán)堿基突變會(huì)影響EBER1與核糖體蛋白L22的結(jié)合，進(jìn)而影響EBER1的促細(xì)胞增殖能力[20]。EB-8m變異型EBERs在 EBER1基因轉(zhuǎn)錄區(qū)序列保守，但在 EBER2基因轉(zhuǎn)錄區(qū)發(fā)生6處突變，其中5處位于莖環(huán)內(nèi)[4，13]。本研究采用Real-time PCR檢測(cè)RNA-PKR免疫共沉淀產(chǎn)物中的EBER2，對(duì)實(shí)驗(yàn)的各環(huán)節(jié)嚴(yán)格定量，將擴(kuò)增反應(yīng)控制在指數(shù)增長(zhǎng)的線性范圍內(nèi)，計(jì)算RNA富集倍數(shù)時(shí)分別以“input”和IgG組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和排除非特異性結(jié)合RNA，獲得的富集倍數(shù)值能在一定程度上反映EBER2與PKR蛋白的結(jié)合能力。由于EBER2-8m變異型EBER2的富集倍數(shù)高于野生型EBER2，且Western blot結(jié)果也顯示EBER2-8m對(duì)PKR磷酸化的抑制作用更為明顯，提示EB-8m變異型在EBER2二級(jí)結(jié)構(gòu)莖環(huán)處發(fā)生的突變可能促進(jìn)EBER2與PKR的結(jié)合，增強(qiáng)了對(duì)PKR磷酸化的抑制作用，進(jìn)而提高了細(xì)胞的抗凋亡能力。EBER2變異如何影響其與PKR的結(jié)合尚需進(jìn)一步研究。

對(duì)PKR通路相關(guān)因子的檢測(cè)結(jié)果顯示野生型和變異型EBER2均可抑制eIF2α和c-Jun磷酸化并 上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，該結(jié)果與以往EBERs在其他幾種細(xì)胞中的結(jié)果類似。如在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系A(chǔ)kata中，EBERs過表達(dá)可通過與PKR結(jié)合抑制eIF2α磷酸化[8]；在雙鏈RNA類似物poly(I)：poly(C)處理后的鼻咽上皮細(xì)胞NP69中，EBERs過表達(dá)導(dǎo)致PKR、p38 MARK和c-Jun的磷酸化水平降低，Bcl-2水平升高，凋亡標(biāo)志物caspase-3和PARP裂解產(chǎn)物的表達(dá)水平降低[7]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)通路是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的重要通路，c-Jun磷酸化被抑制可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[21-22]； B cl-2是最有代表性的凋亡抑制基因[23]。eIF2α是PKR激活后的直接作用底物[15-16]，而 c- J un和 B cl-2也可以作為PKR調(diào)節(jié)的下游基因[24-26]，本研究 EBER2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PKR磷酸化被抑制，上述3種基因磷酸化和表達(dá)也隨之發(fā)生變化，進(jìn)一步證實(shí)PKR對(duì)3種基因的調(diào)控作用。同時(shí)變異型EBER2對(duì)PKR磷酸化的抑制作用比野生型EBER2更為顯著，且在HONE1細(xì)胞中，變異型EBER2 對(duì)eIF2α的抑制作用亦比野生型EBER2明顯，但變異型和野生型EBER2轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間c-Jun磷酸化和Bcl-2表達(dá)尚無明顯差異，提示EBER2變異型可能還通過PKR 以外的途徑調(diào)節(jié)c-Jun磷酸化和Bcl-2表達(dá)。

總之，本研究結(jié)果表明EB-8m變異型EBER2可能增強(qiáng)EBER2與PKR的結(jié)合作用及對(duì)PKR磷酸化的抑制作用，同時(shí)抑制eIF2α和c-Jun磷酸化并上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)NPC細(xì)胞的抗凋亡能力。