李 慧，胡成久*

（1．濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東濟(jì)寧 272029；2．濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院病理科，山東 濟(jì)寧 272011）

皮膚瘢痕癌是一種在皮膚病理性瘢痕基礎(chǔ)上，被覆上皮發(fā)生癌變的惡性腫瘤。好發(fā)于四肢，以鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)最常見，其次是基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma，BCC)。據(jù)報(bào)道燒傷瘢痕大約有2%發(fā)生癌變[1]，目前其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。鼠雙微體2(murine double minute 2， M DM2)是一種抑制細(xì)胞凋亡的癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多惡性腫瘤存在MDM2的高表達(dá)[2]。研究發(fā)現(xiàn)， M DM2基因異常能顯著增加患非色素性皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)[3]。MDM2與皮膚病理性瘢痕癌變是否相關(guān)及作用機(jī)制，目前尚不清楚。本研究采用免疫組化法和RNA原位雜交技術(shù)，探討MDM2蛋白和mRNA的表達(dá)與皮膚病理性瘢痕癌變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

選取于2011年1月—2016年12月濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院病理科的存檔蠟塊共45例。蠟塊標(biāo)本分為皮膚瘢痕癌、皮膚病理性瘢痕和正常皮膚3組。瘢痕癌為20例，從皮膚病理性瘢痕形成到癌變，時間長短不一，為3～21年，均為鱗狀細(xì)胞癌；皮膚病理性瘢痕為15例，正常皮膚為10例。

1.2 主要試劑

鼠抗人MDM2單克隆抗體及二抗MaxVisionTM試劑盒，購于北京中杉金橋公司。MDM2 mRNA原位雜交試劑盒，購于武漢博士德生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化染色法 食管癌組織為陽性對照，用PBS代替一抗為陰性對照。3組標(biāo)本均4 μm切片，二甲苯脫蠟后水化，抗原修復(fù)，每張切片滴加20 μL MDM2抗體覆蓋組織，4 ℃過夜，PBS緩沖液沖洗，滴加酶標(biāo)二抗，室溫20 min后沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。染色結(jié)果由病理醫(yī)生在光鏡下觀察并進(jìn)行判讀。

1.3.2 RNA原位雜交技術(shù) 用預(yù)雜交液代替探針為陰性對照，陽性對照同上。標(biāo)本采用6 μm切片，每張切片滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37 ℃消化30 min，PBS沖 洗 后 固 定10 min， 滴 加20 μL MDM2 mRNA探針，40 ℃雜交過夜，雜交后洗滌，滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃、60 min，相繼滴加SABC及生物素化過氧化物酶，DAB顯色，其余步驟同上。光鏡下判讀染色結(jié)果。

1.4 結(jié)果判斷

MDM2蛋白以細(xì)胞核和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒判定為陽性；MDM2 mRNA以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃顆粒判定為陽性。采用半定量積分法，根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積來判定。根據(jù)積分判定為4個等級：≤2分為陰性(-)，>2～3分為弱陽性(+)，≥3～6分為陽性(++)，≥6分為強(qiáng)陽性(+++)。

每張切片選取隨機(jī)5個不同的高倍視野，運(yùn)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分別測出MDM2蛋白和mRNA陽性著色的平均光密度(opticai density，OD)和陽性面積與分析區(qū)域面積的比值(positive area/analysis area，PA)，OD值越大即表達(dá)強(qiáng)度越高，PA值越大即表達(dá)水平越高，各取其平均值并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 MDM2蛋白的表達(dá)

免疫組化法檢測MDM2蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖1。20例瘢痕癌標(biāo)本中，14例強(qiáng)陽性，3例陽性，3例弱陽性；15例皮膚病理性瘢痕標(biāo)本中，1例強(qiáng)陽性，9例陽性，3例弱陽性，2例陰性；10例正常皮膚標(biāo)本中，7例陰性，3例弱陽性，弱陽性區(qū)僅見于基底層。

3組標(biāo)本的表達(dá)強(qiáng)度OD值、表達(dá)水平PA值有顯著性差異(FOD= 14.082， POD< 0.05； FPA= 10.419， PPA<0.05)，在正常皮膚組、皮膚病理性瘢痕組、瘢痕癌組中的MDM2蛋白表達(dá)逐漸升高，組間 兩 兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如表1所示。

A：在正常皮膚表皮中MDM2蛋白呈弱陽性表達(dá)；B：在皮膚病理性瘢痕上皮中MDM2蛋白呈陽性表達(dá)；C：在皮膚瘢痕癌中MDM2蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá).

與正常皮膚組比較，**P<0.01；與皮膚瘢痕組比較， #P <0.01.

2.2 MDM2 mRNA的表達(dá)

RNA原位雜交法檢測MDM2 mRNA表達(dá)，結(jié)果見圖2。20例瘢痕癌組織標(biāo)本中，15例陽性，4例弱陽性，1例陰性；15例皮膚病理性瘢痕標(biāo)本中，1例陽性，12例弱陽性，2例陰性；10例正常皮膚標(biāo)本中，9例陰性，1例弱陽性。

3組標(biāo)本的MDM2 mRNA表達(dá)強(qiáng)度OD值、表達(dá)水平PA值差異顯著(FOD= 16.009， POD< 0.05； FPA=20.819，PPA< 0.05)，在正常皮膚組、皮膚病理性瘢痕組、瘢痕癌組中的MDM2 mRNA表達(dá)逐漸升高，組間 兩 兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如表2所示。

圖2 RNA 原 位雜交檢測M DM2 mRNA 的 表達(dá)情況(× 4 00)

表2 MDM2 mRNA在 正常皮膚、皮膚病理性瘢痕和瘢痕癌中的表達(dá)(-x±s)

3 討 論

MDM2是一種進(jìn)化保守的癌基因，位于人染色體12q13~14區(qū)，其編碼蛋白和抑癌基因 P 53之間通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)進(jìn)行相互作用[4]。野生型P53能促進(jìn)激活MDM2的轉(zhuǎn)錄功能，使MDM2蛋白合成增加及表達(dá)升高；同時，過表達(dá)的MDM2蛋白與野生型P53相互結(jié)合，阻礙了野生型 P 53基因的轉(zhuǎn)錄激活，使野生型P53蛋白合成減少并維持在低水平，顯著降低其對腫瘤的抑制作用。另外，MDM2還能夠通過激活E2F1促進(jìn)細(xì)胞G1→S期的轉(zhuǎn)變，加快細(xì)胞周期的循環(huán)[4-5]。因而， M DM2作為癌基因，既能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存活力，又能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生和生長。許多惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展和癌基因 M DM2的作用相關(guān)[5]。Michalk等[6]對127例食管鱗狀細(xì)胞癌采用定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，其中23例存在 M DM2基因的擴(kuò)增和表達(dá)；Li等[7]通過藥物減少小鼠皮膚黑色素瘤中MDM2的表達(dá)，與對照組比較，MDM2低表達(dá)抑制了腫瘤的生長；Wang等[8]運(yùn)用腺病毒載體介導(dǎo) M DM2基因沉默，使皮膚鱗狀細(xì)胞癌的增殖得到有效控制，同時誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常皮膚組MDM2蛋白的表達(dá)為陰性或弱陽性，皮膚病理性瘢痕組MDM2蛋白的表達(dá)為陽性，瘢痕癌組MDM2蛋白的表達(dá)為強(qiáng)陽性；正常皮膚組MDM2 mRNA的表達(dá)大部分為陰性，皮膚病理性瘢痕組MDM2 mRNA的表達(dá)為弱陽性，瘢痕癌組MDM2 mRNA的表達(dá)為陽性。在正常皮膚、皮膚病理性瘢痕及瘢痕癌共3組樣本的 m RNA水平和蛋白水平中，MDM2 均顯示出表達(dá)強(qiáng)度、表達(dá)水平的逐漸升高趨勢；瘢痕癌組分別與皮膚病理性瘢痕組、正常皮膚組相比較，均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示瘢痕癌的發(fā)生可能與MDM2、MDM2 mRNA的持續(xù)高表達(dá)有關(guān)?？赡艿臋C(jī)制為 ， MDM2的持續(xù)高表達(dá)阻遏了野生型 P 53基因的轉(zhuǎn)錄激活功能，并使野生型P53蛋白表達(dá)水平維持在低水平，同時，MDM2通過促進(jìn)細(xì)胞G1向S期的轉(zhuǎn)變使細(xì)胞周期的循環(huán)加速，異常細(xì)胞生存延長及增殖失控，導(dǎo)致瘢痕癌變及腫瘤的發(fā)生。

同時，皮膚病理性瘢痕組MDM2蛋白、MDM2 mRNA的表達(dá)水平均高于正常皮膚組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示病理性瘢痕可能是一種癌前病變，檢測MDM2蛋白、MDM2 mRNA水平有可能作為一個早期指標(biāo)，預(yù)測皮膚病理性瘢痕癌變。