韓仁杰吳傳城劉寶英 *郭賽熊陳 昱

（1. 福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建福州 350108；2. 福建省莆田市仙游縣醫(yī)院，福建 莆田 351200）

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，居消化系統(tǒng)腫瘤的首位[1]。加強(qiáng)對胃癌高發(fā)區(qū)高危人群發(fā)生胃癌危險性的監(jiān)控，對胃癌的防治有重要的現(xiàn)實意義[2]。近年來大量的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)某些基因3′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)有許多單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與腫瘤的易感性顯著相關(guān)，研究表明基因3′UTR的SNPs與人類疾病相關(guān)的機(jī)制之一，是其存在miRNA的結(jié)合位點[3]，這些SNPs的存在有可能影響miRNA-mRNA配對的有效性以及結(jié)合數(shù)量，從而通過影響基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。本研究采用SNP芯片聯(lián)合飛行時間質(zhì)譜技術(shù)篩檢福建省仙游縣胃癌患者血液中差異的消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs，采用病例-對照研究分析芯片篩選出來的SNPs與胃癌易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究方法與對象

采用1∶1配對的病例-對照研究，胃癌病例來源于福建省仙游縣醫(yī)院的胃癌新發(fā)病例。大樣本納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)手術(shù)或內(nèi)窺鏡取得組織標(biāo)本，經(jīng)病理確診的新發(fā)病例；確診日期為2013年4月至2017年10月；在仙游本地居住10年以上。芯片組納入標(biāo)準(zhǔn)是在此基礎(chǔ)上選擇男性，年齡50~70歲之間，經(jīng)病理確診為胃腺癌的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為胃部炎癥、良性病變及病情危重或不能清晰回答問題者及腫瘤繼發(fā)病例和復(fù)發(fā)病例。

健康對照納入標(biāo)準(zhǔn)：按性別、年齡、地區(qū)與病例進(jìn)行配對，其中芯片健康對照選擇年齡±3歲與病例進(jìn)行配對，大樣本健康對照選擇年齡±5歲與病例進(jìn)行配對。選擇在仙游本地居住10年以上者。排除標(biāo)準(zhǔn)為：胃癌或慢性萎縮性胃炎的直系家屬。

以上標(biāo)本均要求資料和血樣完整，最后SNP芯片篩選階段我們納入96例胃癌患者和96例對照，均為男性，年齡分布在52~71歲之間。其中病例組平均年齡(63.84±4.64)歲，對照組平均年齡(63.84±4.66)歲。

在驗證階段納入確診胃癌病例622例，正常對照622例，其中男性466對，女性156對。病例組由312例賁門癌患者和310例非賁門癌患者組成。病例組年齡分布在39~89歲之間，平均年齡為(67.32±9.72)歲；對照組年齡分布在41~87歲之間，平均年齡為(67.22±9.65)歲。經(jīng)均衡性檢驗，病例組與對照組在年齡、性別、職業(yè)等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。病例組中高中及以上的文化程度比例低于對照組，已婚的比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1.2 資料收集

采用統(tǒng)一設(shè)計的調(diào)查表，進(jìn)行面對面的訪談式調(diào)查。病例的病史資料經(jīng)患者本人及醫(yī)院同意后通過摘錄電子病歷獲得。調(diào)查內(nèi)容包括研究對象的年齡、性別、文化程度、婚姻狀況、職業(yè)史等相關(guān)因素，同時采集病例及對照人群的空腹外周靜脈血5 mL，抽取的血樣置于EDTA抗凝管，3 000 r/min離心10 min后，分裝成血漿、白細(xì)胞、紅細(xì)胞，置-80 ℃低溫冰箱保存。本研究涉及的調(diào)查數(shù)據(jù)及人體數(shù)據(jù)，均已通過福建醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的審查，符合醫(yī)學(xué)倫理相關(guān)規(guī)定和要求。

1.3 芯片基因分型原理與方法

1.3.1 基因分型原理 本過程通過Affymetrix Axiom SNP芯片對芯片中消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs進(jìn)行基因分型，基因芯片分型技術(shù)采用酶介導(dǎo)及單堿基測序的全自動化流程。

1.3.2 消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs的篩選方法 利用KEGG-PATHWAY數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway)搜索食管癌、胃癌、腸癌、肝癌等消化道腫瘤相關(guān)基因。根據(jù)dbSNP數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)篩選位于這些基因3′ UTR的SNPs。將篩選出的SNPs與芯片位點做交集。再利用SPSS和Excel軟件對所有的消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs進(jìn)行卡方檢驗，選取 P<0.10的位點；根據(jù)千人基因網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000 genomes/)查找各位點的最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)，選擇MAF在0.15~0.40的位點；對各多態(tài)性位點進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡度檢驗，選取基因型頻率分布在健康對照人群中符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的位點進(jìn)行后續(xù)實驗分析。

1.3.3 大樣本人群中miRNA基因分型原理與方法 將芯片中篩選得到的5個SNPs位點區(qū)域的DNA模板通過PCR技術(shù)擴(kuò)增，再使用特異的延伸引物與PCR產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)，檢測延伸產(chǎn)物相對分子質(zhì)量，應(yīng)用專用的分析軟件，通過判斷分子大小的差異而進(jìn)行SNP分型檢測。

1.4 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計

對芯片選取的5個SNP位點進(jìn)行基因型鑒定，使用Sequenom公司Genotyping Tools及Mass ARRAY Assay Design軟件設(shè)計待測SNP位點的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，見表1。

1.5 質(zhì)量控制

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按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制：①所有病例均經(jīng)過病理確診；②芯片分型過程中使用評估信號值分布與背景信號值的差異(Dish QC)對樣品進(jìn)行質(zhì)控，Dish QC低于0.82的樣品不納入后續(xù)的分型中；③基因型的判讀采用盲法；④芯片檢測與MALDI-TOF-MS檢測進(jìn)行結(jié)果一致性比較；⑤少數(shù)樣本由于DNA質(zhì)量或者濃度問題，未能檢測出基因型的樣本予以剔除。

1.6 統(tǒng)計分析

所有實驗室基因型數(shù)據(jù)經(jīng)過核實后建立數(shù)據(jù)庫，采用 χ2檢驗對病例組和對照組的一般人口學(xué)資料進(jìn)行均衡性檢驗；采用 χ2檢驗計算對照組的各基因多態(tài)性位點分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律(H-W平衡)；采用Cox Regression命令擬合條件Logistic模型對單個位點的基因型、等位基因進(jìn)行單因素Logistic分析，計算其比值比(odds ratio， O R)及95%可信區(qū)間(confidential interval， C I)。以上分析均采用SPSS 21.0軟件包完成。所有 P值基于雙側(cè)檢驗，統(tǒng)計學(xué)檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 芯片中消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs篩選情況

按照消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs篩選策略，最終選出5個與胃癌相關(guān)的消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs，見圖1。分別為表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR) EG FR rs884225 C>T， EGFR r s10277413 G>T，F(xiàn) A S r s1468063 C>T，MSH2 rs17502941 A >G，M SH2 r s11125144 A >G，見表2。

2.2 消化道腫瘤相關(guān)基因多態(tài)性與胃癌關(guān)聯(lián)性分析

本次選取的5個SNPs位點的基因型頻率分布在對照組中符合H-W 平衡(P >0.05)。經(jīng)婚姻狀況、文化程度等危險因素校正的條件Logistic回歸分析未發(fā)現(xiàn)兩位點與胃癌易感性相關(guān)，見表3。對病例-對照的分層分析顯示rs884225中含有T等位基因的基因型(CT+TT)與賁門癌相關(guān)(O R= 0.67，95% C I：0.46~0.99)，而其他位點與賁門癌、非賁門癌的風(fēng)險關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

圖1 消化道腫瘤相關(guān)基因 3 ′UTR區(qū) S NPs篩選情況圖

表2 有差異的消化道腫瘤相關(guān)基因3 ′UTR 區(qū) S NPs 及其基本信息

2.3 單體型分析

2.3.1 EGFR基因單體型分析 我們所研究的EGFR基因2個多態(tài)性位點共可產(chǎn)生4個單體型SNP位點，排列順序依次為rs884225、rs10277413，結(jié)果單體型1~4在病例和對照組的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5和表6。

2.3.2 MSH2基因單體型分析MSH2基因2個多態(tài)性位點共可產(chǎn)生4個單體型SNP位點，排列順序依次為rs17502941、rs11125144，結(jié)果單體型1~4在病例和對照組的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表7和表8。

3 討 論

近年來發(fā)現(xiàn)miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)進(jìn)而參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而miRNA與SNP均在分子水平上對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定的調(diào)控作用[5]，因此探索miRNA與SNP之間的相互作用對腫瘤的作用不容忽視。miRNA編碼基因本身可存在SNPs位點[6]，而在靶基因mRNA 3′UTRs的miRNA結(jié)合位點上也有可能存在SNPs位點[7]，單個堿基的改變均有可能影響miRNA與mRNA配對的有效性以及結(jié)合數(shù)量，從而在轉(zhuǎn)錄后水平改變靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)[8]。由于miRNA片段小，發(fā)生在miRNA編碼基因上的SNP數(shù)量少，而miRNA與靶基因結(jié)合位點上的SNPs可減弱相應(yīng)miRNA對靶基因的翻譯抑制效應(yīng)，增強(qiáng)靶基因表達(dá)或者形成新的miRNA結(jié)合位點，從而抑制靶基因的表達(dá)[9]。若該基因與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，則發(fā)生在其3′非翻譯區(qū)的SNP可影響胃癌的易感性。目前對于miRNA靶位點的SNP與腫瘤的研究多采用生物信息學(xué)預(yù)測的方法[10]，由于預(yù)測結(jié)果缺乏一定的可靠性，因此在本研究中我們采用SNP芯片對消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs位點進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，然后通過飛行時間質(zhì)譜法驗證，最后發(fā)現(xiàn)1個SNP位點與賁門癌易感性相關(guān)。

表3 消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs與胃癌的關(guān)聯(lián)程度

本次研究首先通過生物信息學(xué)方法篩選出43個消化道腫瘤相關(guān)基因共計10 494個3′UTR區(qū)SNPs位點。但其中包含了許多SNPs位置相同但名稱不一致的位點，我們?yōu)榱瞬贿z漏地篩選出消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs，將所有通過生物信息學(xué)篩選出的SNPs位點與SNP芯片中的位點做交集，發(fā)現(xiàn)有9個消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs位點在芯片中。通過卡方檢驗分析后發(fā)現(xiàn)有5個SNPs位點基因分型在病例對照組中分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，然后對該5個SNPs位點進(jìn)行大樣本驗證，最后篩查出來的5個SNPs中發(fā)現(xiàn)EGFR rs884225與賁門癌的易感性相關(guān)(P<0.05)，而其他位點與胃癌發(fā)病風(fēng)險無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。有文獻(xiàn)報道EGFR rs884225[11]及 F AS rs1468063[12]均與胃癌的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)，而其他位點還未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

表4 消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs與不同胃癌部位的關(guān)聯(lián)程度

表5 EGFR不同單體型在胃癌人群中的分布情況

表6 EGFR不同單體型在賁門癌、非賁門癌人群中的分布情況

表7 MSH2不同單體型在胃癌人群中的分布情況

表8 MSH2不同單體型在賁門癌、非賁門癌人群中的分布情況

表皮生長因子受體(EGFR)是HER/cerb-B家族跨膜受體酪氨酸激酶成員[13]，能促進(jìn)上皮細(xì)胞增生，與乳腺癌[14]、 非小細(xì)胞肺癌[15]、 結(jié)直腸癌[16]等多種腫瘤密切相關(guān)。大量研究表明， EGFR基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及遺傳有關(guān)[17-18]。而發(fā)生在其3′UTR的SNP將影響miRNA的調(diào)控作用，新的SNP可以減弱相應(yīng)miRNA對其翻譯的抑制效應(yīng)，增強(qiáng)靶基因表達(dá)或者形成新的miRNA結(jié)合位點，從而抑制靶基因的表達(dá)。

進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量后的病例-對照研究方法發(fā)現(xiàn)EGFRrs884225 C>T攜帶CT+TT基因型的個體與CC基因型相比，患賁門癌的風(fēng)險明顯增加。且根據(jù)多個生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)miR-31、miR-214可與 EGFR r s884225位點C等位基因結(jié)合，而EGFR rs884225位點C等位基因突變成T等位基因后，會增加更多miRNA的調(diào)控作用，形成miR-103、miR-107、miR-424、miR-486-3p、miR-497與 EGFR的新的結(jié)合位點，從而抑制了 EGFR基因的翻譯過程，對賁門癌的發(fā)生具有一定的保護(hù)作用，這與我們的結(jié)果是相一致的。為了進(jìn)一步探討單體型對胃癌發(fā)生風(fēng)險的影響，分別聯(lián)合了 EGFR( r s884225、rs10277413)和MSH2(rs17502941、rs11125144)基因的2個3′UTR SNPs位點構(gòu)建單體型，但均未發(fā)現(xiàn)單體型與胃癌、賁門癌、非賁門癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。

本次研究從消化道腫瘤相關(guān)基因3′UTR區(qū)SNPs角度探討新發(fā)現(xiàn)的SNP位點是否存在與胃癌相關(guān)的遺傳易感標(biāo)志物。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， EGFR基 因3′UTR的rs884225多態(tài)性位點改變可能引起miRNA對其表達(dá)調(diào)控過度導(dǎo)致在體內(nèi)低表達(dá)，從而抑制賁門癌的發(fā)生，但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步實驗驗證。miRNA靶基因3′UTR SNPs與腫瘤關(guān)系的分子流行病學(xué)研究是目前的熱點[19]，通過分子流行病學(xué)的研究積累，可以對腫瘤的發(fā)生有較好的預(yù)見作用，進(jìn)而有利于腫瘤的預(yù)防甚至是預(yù)后的判斷。[20]