姜朋濤，胡志芳，高興春，郭 娜，張 典，姜鳳良*

（西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)教研室，西安 710021）

全球乳腺癌占女性癌癥發(fā)病總例數(shù)的25%，占女性癌癥死亡總例數(shù)的15%[1]。中國(guó)乳腺癌統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)雖顯著低于此數(shù)值，但是人口基數(shù)大，而且發(fā)病數(shù)和死亡率均逐年上升[2]。所以，乳腺癌嚴(yán)重威脅女性的健康，對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的研究具有重大意義。目前乳腺癌發(fā)病機(jī)制的探索主要集中在癌細(xì)胞的存活、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制等多個(gè)方面，其中基因組遺傳學(xué)改變是其中一個(gè)重要的研究方向[3]?；蚪M遺傳學(xué)改變(DNA損傷等)可以自發(fā)產(chǎn)生，但是更多見(jiàn)于各種理化因素所致，比如紫外線、電離輻射、某些藥物等。DNA損傷嚴(yán)重時(shí)可以引起乳腺細(xì)胞的死亡，而低劑量的DNA損傷可引起乳腺細(xì)胞功能蛋白發(fā)生突變導(dǎo)致細(xì)胞癌變的發(fā)生。p53蛋白是一個(gè)重要的DNA損傷修復(fù)蛋白，一旦其自發(fā)或者誘發(fā)產(chǎn)生突變，均會(huì)引起細(xì)胞癌變[4]。所以，探索DNA損傷及損傷后修復(fù)過(guò)程中p53等相關(guān)蛋白的功能改變對(duì)于深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制有重要意義。本文擬初步研究在紫外線照射引起的乳腺癌細(xì)胞DNA損傷從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生輕度死亡過(guò)程中乳腺癌細(xì)胞基因組遺傳學(xué)改變相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，這將為治療乳腺癌尋找新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MDA-MB-231細(xì)胞系購(gòu)自上海細(xì)胞研究所；用于此細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒為日本同仁化學(xué)公司產(chǎn)品。剪切PARP抗體(c-PARP，1∶2 000，兔)、p21(1∶ 2 000， 兔 )、 Actin(1∶ 5 000， 鼠 )為 Cell Signaling公司產(chǎn)品；磷酸化p53(p-p53，1∶500，兔)，p53(1∶500，鼠)，磷酸化H2AX(p-H2AX，1∶500，鼠)為Abcam公司產(chǎn)品；NF-90(1∶1 000，鼠)為Santa Cruz公司產(chǎn)品。羊抗鼠-HRP(1∶2 500，115-035-003)和羊抗兔-HRP(1∶2 500，111-035-003)均為美國(guó)Jackson Immuno公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA損傷誘導(dǎo) 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用短波紫外線(UVC，簡(jiǎn)稱UV，100 nm<波長(zhǎng)<280 nm)照射誘導(dǎo)DNA損傷。根據(jù)紫外線輸出功率計(jì)算本實(shí)驗(yàn)所用UVC照射箱為距離光源30 cm處時(shí)，照射1 s為1 J/m2。本實(shí)驗(yàn)選擇照射5和20 s時(shí)劑量分別為5和20 J/m2，同時(shí)設(shè)未照射細(xì)胞為對(duì)照組。照射完成后細(xì)胞繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱中孵育相應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同劑量紫外線(5和20 J/m2)處理后，繼續(xù)孵育24 h，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行檢測(cè)，每孔加入10 μL CCK-8后2 h，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取 D(450)值，檢測(cè)不同強(qiáng)度紫外線處理后細(xì)胞的增殖情況。

1.2.3 Western blot檢測(cè)紫外線處理后不同時(shí)間磷酸化H2AX及相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平 由于磷酸化H2AX蛋白是DNA損傷的標(biāo)志物[5]，通過(guò)檢測(cè)其表達(dá)水平可以反映是否引起了細(xì)胞DNA損傷，同時(shí)檢測(cè)與DNA損傷機(jī)制相關(guān)的p-p53、 p 53、 NF-90等蛋白。收集5 J/m2紫外線處理后不同時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、8、12和24 h)的細(xì)胞，用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞，BCA(bicinchoninic acid)法測(cè)定細(xì)胞提取上清中的蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)上樣量為50 μg，配置SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶孵育2 h后滴加一抗(詳見(jiàn)材料部分)，4 ℃孵育過(guò)夜；第2天， 滴 加二抗室溫孵育1 h。常規(guī)顯影、定影。應(yīng)用FIJI 軟件(http://fiji.sc/，基于Image J的圖像分析軟件)對(duì)Western blot膠片進(jìn)行灰度分析，計(jì)算相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量[6]。

1.2.4 紫外線處理后不同時(shí)間點(diǎn)c-PARP和p21蛋白表達(dá)的變化 檢測(cè)PARP剪切(c-PARP)水平，可提示DNA損傷的修復(fù)功能受到影響的程度，這也是細(xì)胞死亡有一定增多的原因。而p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase，CDK)家族中的重要成員，p21的表達(dá)增加，最終引起細(xì)胞周期G1阻滯的發(fā)生。為了探究紫外線引起細(xì)胞死亡的原因，我們通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了5 J/m2紫外線處理細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、8、12和24 h)后c-PARP和p21蛋白表達(dá)的變化。Western blot檢測(cè)方法同1.2.3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Excel作圖及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以x± s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以α =0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同強(qiáng)度紫外線照射對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，與對(duì)照組(未照射組)比較，5和20 J/m2的UV C照 射MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，5 J/m2處理組即可以引起細(xì)胞死亡增加、增殖減慢(存活率89%，P<0.05)，而當(dāng)細(xì)胞在20 J/m2的紫外線照射后，細(xì)胞發(fā)生明顯死亡(存活率僅為22%， P<0.01)。由于本文目的為檢測(cè)DNA損傷時(shí)乳腺癌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)將使用引起細(xì)胞死亡較溫和的5 J/m2處理細(xì)胞。

圖1 不同強(qiáng)度紫外線處理后細(xì)胞的存活情況

2.2 紫外線照射引起p-H2AX水平的變化

圖2 為Western blot蛋白免疫印跡法檢測(cè)DNA損傷和細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白c-PARP、p-p53、p53、p21、NF-90和p-H2AX結(jié)果。圖3所示為p-H2AX與對(duì)照組比較的相對(duì)表達(dá)量，5 J/m2紫外線處理后0.5 h即可引起細(xì)胞DNA損傷(p-H2AX)增加(P<0.05)，到2 h后，引起細(xì)胞DNA損傷增加非常明顯(P<0.05)，12 h時(shí)磷酸化H2AX蛋白達(dá)峰值(P<0.05)，直到我們的檢測(cè)終點(diǎn)24 h，DNA損傷較12 h時(shí)降低，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明紫外線處理后DNA損傷非常明顯。

圖2 Westernblot檢 測(cè)U VC 處理不同時(shí)間后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

圖3 UVC處 理后不同時(shí)間點(diǎn) p -H2AX蛋白表達(dá)的變化

2.3 UVC通過(guò)p21-PARP通路引起細(xì)胞死亡增加

如圖4A所示，與對(duì)照組比較，UVC處理8、12和24 h后c-PARP水平均明顯升高(P<0.05)，這提示細(xì)胞發(fā)生死亡，DNA損傷的修復(fù)功能受到影響。而p21在細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷中均發(fā)揮著重要作用，它的降解將直接導(dǎo)致細(xì)胞DNA修復(fù)功能的損傷，與細(xì)胞死亡直接有關(guān)[7]。圖4B顯示在紫外線處理0.5 h后即開(kāi)始出現(xiàn)p21的降解，并且p21的表達(dá)水平持續(xù)偏低(P<0.05)，所以DNA損傷的修復(fù)功能受損與p21的快速降解密切相關(guān)。

2.4 p53參與調(diào)控DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

圖4 UVC處 理后不同時(shí)間點(diǎn) c- PARP 和 p21蛋白表達(dá)的變化

在p21蛋白持續(xù)低水平表達(dá)時(shí)，乳腺癌細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞大部分死亡。那么，什么因素參與調(diào)控這一過(guò)程呢？p21是p53重要的下游分子，同時(shí)，野生型p53可以參與對(duì)p21的調(diào)控。所以我們檢測(cè)了p53的改變。如圖5A所示，與DNA損傷一致，在處理早期就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DNA損傷相關(guān)分子p53的磷酸化增加，在此過(guò)程中，p53并未見(jiàn)顯著性變化(圖5B)。由于核因子NF-90與NF-45形成異源二聚體在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控p53和p21的表達(dá)[8]。所以我們同時(shí)對(duì)NF-90的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-90的表達(dá)并無(wú)明顯改變，這就提示我們這一過(guò)程不依賴于NF-90蛋白量的改變(圖6)。這些結(jié)果提示p53并未參與p21降解引起的細(xì)胞死亡增多，那么它的增多發(fā)揮什么作用及其具體機(jī)制仍有待我們進(jìn)一步研究。

圖5 UVC處理后不同時(shí)間點(diǎn)p-p53和p53蛋白表達(dá)的變化

3 討 論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素導(dǎo)致的乳腺細(xì)胞DNA損傷修復(fù)缺失密切相關(guān)，DNA損傷引起細(xì)胞周期阻滯后細(xì)胞啟動(dòng)DNA修復(fù)過(guò)程，這其中包括多種功能蛋白的參與，比如ATM、BRCA-1、p53和PARP-1等[9]。在此過(guò)程中任何步驟或分子發(fā)生改變均可引起細(xì)胞癌變的發(fā)生，所以細(xì)胞對(duì)于DNA損傷后啟動(dòng)的保護(hù)機(jī)制需要我們進(jìn)一步闡明[10]。

本文通過(guò)紫外線體外誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，發(fā)現(xiàn)在低劑量時(shí)雖然有PARP的剪切發(fā)生，這一過(guò)程與p21的快速降解密切相關(guān)，細(xì)胞發(fā)生少量死亡。p21作為一種細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制劑，它的表達(dá)水平在多種DNA損傷刺激時(shí)均可增高，引起細(xì)胞阻滯的發(fā)生，為DNA損傷的修復(fù)提供時(shí)間。但是對(duì)于其在DNA修復(fù)中的作用仍有爭(zhēng)議[11]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)p21 由于受到DNA損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)泛素化降解[12]。本實(shí)驗(yàn)觀察的DNA損傷后p21快速降解(圖4B)也驗(yàn)證了這一結(jié)果。另外，p21在細(xì)胞死亡中的作用也存在巨大爭(zhēng)議。一般認(rèn)為，p53引起p21的表達(dá)增加，可以有效抑制細(xì)胞死亡的發(fā)生，但也有相反的報(bào)道，如p21高表達(dá)的細(xì)胞在UV刺激的時(shí)候可以引起p53依賴的細(xì)胞死亡增加[13]。總之，p21由于細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞定位、p53狀態(tài)和DNA損傷刺激的不同發(fā)揮著不同作用[14-15]。本文中我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示p21的快速降解導(dǎo)致DNA修復(fù)功能的缺失，PARP剪切增多，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，但是細(xì)胞死亡并不十分明顯(與高劑量相比)。那么，在這一過(guò)程中抑制細(xì)胞死亡的機(jī)制是什么呢？

p53是一個(gè)重要的抑癌基因，它在DNA損傷修復(fù)中也發(fā)揮著重要作用[16]。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，p53磷酸化增加，從而導(dǎo)致與鼠雙微粒體(murine double minute 2， M DM2)親和力降低，p53被功能性釋放繼而激活下游DNA損傷修復(fù)蛋白，同時(shí)它募集下游分子如p21，引起細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，這樣細(xì)胞就有足夠的時(shí)間對(duì)基因組進(jìn)行修復(fù)，如果不能有效修復(fù)，p53又可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。但是，由于p53被鑒定出是癌癥中最容易發(fā)生突變的蛋白之一，突變導(dǎo)致上述功能的缺失，最終引起細(xì)胞癌變的發(fā)生[18]。乳腺癌相關(guān)的實(shí)體瘤或者細(xì)胞系中存在多種p53突變，在MDA-MB-231細(xì)胞中存在p53 R280K突變，此突變可以參與促進(jìn)細(xì)胞存活的調(diào)控[19]，并最終參與抑制DNA損傷對(duì)MDAMB-231細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)作用。綜上所述，結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，突變的p53磷酸化增加促進(jìn)其參與抑制細(xì)胞死亡的發(fā)生。

同時(shí)，我們對(duì)p53和p21的調(diào)控進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示NF-90的表達(dá)水平并未發(fā)生明顯改變。NF-90是剪切體的一個(gè)成員，含有雙鏈RNA結(jié)合區(qū)域，它可以從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞漿結(jié)合在p21的3′UTR區(qū)從而穩(wěn)定p21 mRNA[20]。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將繼續(xù)研究NF-90的轉(zhuǎn)位對(duì)p53和p21的調(diào)控，同時(shí)我們將研究這一過(guò)程中細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白的作用機(jī)制。

由于癌癥細(xì)胞中一些DNA修復(fù)相關(guān)分子多發(fā)生結(jié)構(gòu)或者功能的改變，所以基于這些分子研究其靶向治療藥物是腫瘤靶向治療的一個(gè)重要方向，多種相關(guān)藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)上市[21]。p53和p21既參與腫瘤抑制作用，又能通過(guò)抑制周期素依賴激酶復(fù)合物活性、協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系，促進(jìn)腫瘤存活，所以它們?cè)诓煌?xì)胞系，不同刺激狀態(tài)作用下所表現(xiàn)的功能改變均可以作為腫瘤藥物個(gè)體化治療的靶分子。本研究初步揭示了在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中DNA損傷引起細(xì)胞死亡及其保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步明確了在MDA-MB-231細(xì)胞中DNA損傷時(shí)p53和p21的改變，為基于p53或者p21的腫瘤治療提供了實(shí)驗(yàn)支持。