閆 冬，吳怡嫻，董娟娟，李秀梅，封 敏*

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；3. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

食管癌的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失調(diào)的結(jié)果，Survivin、c-myc在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中表達(dá)上調(diào)，但Survivin、c-myc共同高表達(dá)的機(jī)制并不十分清楚，在前期試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)Survivin通過調(diào)控核因子(nuclear Factor-κB ，NF-κB)的上游關(guān)鍵激酶IKK激酶(IκB kinase)的轉(zhuǎn)錄而影響NF-κB蛋白的活化狀態(tài)[1]，充分說明在腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，Survivin是一個(gè)潛在的調(diào)控分子。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子，在正常組織中低表達(dá)， c -myc是 原癌基因，其異常擴(kuò)增及點(diǎn)突變可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂增值。在哈薩克族食管癌組織中Survivin高表達(dá)與cmyc表達(dá)正相關(guān)， c- myc基 因表達(dá)調(diào)控與ERK信號(hào)通路相關(guān)[2]。Survivin調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的功能研究較為透徹，但其作為一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在信號(hào)通路中的作用并不清楚，鑒于此我們推測(cè)Survivin作為潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可能對(duì)c-myc具有調(diào)控作用。故本實(shí)驗(yàn)采用shRNA技術(shù)沉默食管癌ECA109細(xì)胞中Survivin的表達(dá)后觀察c-myc及ERK激酶活化蛋白的表達(dá)變化，初步探討Survivin對(duì)c-myc的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、引物與試劑

食管癌ECA109細(xì)胞系由新疆醫(yī)科大學(xué)科研中心提供，Survivin短發(fā)夾RNA質(zhì)粒(Survivin shRNA plasmid)、陰性短發(fā)夾RNA質(zhì)粒(control shRNA plasmid)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(shRNA plasmid transfection reagent)，均購于美國Santa Cruz公司；ERK信號(hào)通路阻斷劑PD98059、p38信號(hào)通路阻斷劑SB203580、PI3K信號(hào)通路阻斷劑LY294002、JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑SP600125、JAK阻斷劑AG490均購于德國Sigma公司，兔抗人Survivin、兔抗人c-myc抗體、羊抗兔IgG抗體均購于武漢博士德公司，PCR擴(kuò)增引物購于上海生物工程有限公司。PCR引物序列、產(chǎn)物片段長度及退火溫度如表1。

表1 PCR引物序列、產(chǎn)物片段長度及反應(yīng)條件

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌ECA109細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清以及100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 shRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 分為Survivin shRNA干擾組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組、空白細(xì)胞株(未加任何處理的食管癌ECA109細(xì)胞)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將2 μg Survivin shRNA plasmid和4 μL shRNA plasmid transfection reagent分別用100 μL無血清DMEM 稀釋，5 min后將稀釋好的Survivin shRNA和shRNA plasmid transfection reagent混勻，室溫放置30 min備用。陰性質(zhì)粒制備方法同前。將轉(zhuǎn)染混合物緩慢的逐滴加入食管癌ECA109細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)，放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用5 μg/μL的嘌呤霉素篩選細(xì)胞株，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR收集各組細(xì)胞，采用Trizol試劑一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度。以提取的總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA模板2 μL，待擴(kuò)增基因上下引物各1 μL，即用型PCR反應(yīng)試劑盒反應(yīng)溶液(2倍濃度)10 μL，雙蒸水6 μL，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像分析。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 收集細(xì)胞、加入RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30 min，低溫離心，取上清分裝，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，把蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電壓100 V，時(shí)間90~120 min。然后轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(兔抗人Survivin、兔抗人c-myc抗體，1∶400)，二抗孵育(羊抗兔IgG抗體，1∶400)，X光曝光成像，Quantity One軟件分析目標(biāo)。

1.2.5 信號(hào)通路抑制劑的配置及分組 將PD98059、SB203580、LY294002、SP600125、AG490干粉充分溶解于DMSO溶液中，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)存液，于-20℃冰箱保存，使用前稀釋成指定的濃度。待細(xì)胞生長至匯合度為70%～80%時(shí)，更換為含0.1% FBS的1640培養(yǎng)基24 h使細(xì)胞同步化，根據(jù)分組情況分別加入干預(yù)劑，終濃度為50 μmol/L，24 h后收集細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

- 采 用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以x± s 表 示，各基因的組間比較采用t 檢驗(yàn)；基因間表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)；以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 Survivin shRNA干擾后各組Survivin、c-myc mRNA及蛋白的表達(dá)

Survivin shRNA轉(zhuǎn)染48 h，Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，與陰性質(zhì)粒對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)；c-myc mRNA及蛋白表達(dá)受到抑制，表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、圖2、表2、表3。

圖1 RT-PCR 法 檢測(cè)各組 S urvivin 和 c-myc mRNA 的表達(dá)

圖2 Western blot法 檢測(cè)各組S urvivin 和 c- myc 蛋白的表達(dá)

表2 Survivin shRNA 干 擾后各組S urvivin 和 c-myc mRNA 的表達(dá)變化

表3 Survivin shRNA 干 擾后各組S urvivin 和 c-myc 蛋白的表達(dá)變化

2.2 信號(hào)通路抑制劑處理各組細(xì)胞后c-myc的表達(dá)

各信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑PD98059、SB203580、 LY294002、 SP600125、 AG490作 用 24 h后，PD98059抑制劑組 c- myc基 因的表達(dá)明顯降低，與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余各組未見明顯差異。見圖3和表3。

圖3 信 號(hào)通路抑制劑干預(yù)組 c- myc的表達(dá)

表 信號(hào)通路抑制劑干預(yù)組 的表達(dá)

2.3 Survivin shRNA干擾后ERK磷酸化蛋白的表達(dá)

Western blot電泳結(jié)果顯示，Survivin shRNA轉(zhuǎn)染后48 h，與空白對(duì)照組(1.59±0.28)和陰性質(zhì)粒對(duì)照組(1.63±0.87)比較，p-ERK蛋白磷酸化水平(0.87±0.46)明顯降低，差異顯著(P<0.05)，提示ERK蛋白活化抑制(見圖4)。

圖4 Survivin shRNA 干擾ERK蛋白磷酸化的表達(dá)

3 討 論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在哈薩克族食管癌組織中Survivin與c-myc表達(dá)明顯上調(diào)，且二者的表達(dá)呈正相關(guān)，提示Survivin、c-myc可能協(xié)同發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和抑制細(xì)胞凋亡。Survivin和c-myc這種協(xié)同表達(dá)現(xiàn)象也見于其他腫瘤中[3-4]，但機(jī)制并不清楚。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種由內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA分子(double s trand RNA，dsRNA)介導(dǎo)，特異性降解相應(yīng)序列的mRNA，阻斷或降低同源基因表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的功能缺失現(xiàn)象，RNAi是生物界普遍存在的一種調(diào)控基因表達(dá)的有效方式和鑒定基因功能的重要手段。利用RNAi技術(shù)可以容易地確定復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的上下游關(guān)系及其作用，因此成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途經(jīng)[5]。我們將Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞株48 h后，Survivin mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，c-myc mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，提示在食管癌ECA109細(xì)胞內(nèi)Survivin具有調(diào)控 c- myc基 因表達(dá)的作用。在多種腫瘤組織中Survivin與c-myc表達(dá)具有一致性，在腫瘤中可能起協(xié)同作用，我們推測(cè)高表達(dá)的Survivin可通過調(diào)控作用激活c-myc表達(dá)，而c-myc過度表達(dá)可以直接激活CDK4、cyclin D/E/A、細(xì)胞分裂周期25A等細(xì)胞周期基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、分裂[6-7]。采用shRNA技術(shù)下調(diào)Survivin表達(dá)后，其對(duì)c-myc激活的作用消失或減弱，從而c-myc的表達(dá)也明顯下調(diào)，呈現(xiàn)一致性。

ERK通路、JNK通路、p38通路 和 JAK/STAT通路、PI3K通路是目前研究較多的將細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后都能作用于轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)。我們采用ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑PD98059、p38信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑SB203580、JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑SP600125、PI3K的特異阻斷劑LY294002，JAK化學(xué)阻斷劑AG490分別阻斷了ERK、p38、JNK、PI3K、JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵激酶ERK、p38、JNK、PI3K、STAT3的活化，RT-PCR、Western-blot結(jié)果顯示PD98059抑制劑組c-myc mRNA和蛋白的表達(dá)降低，與空白細(xì)胞組相比差異顯著，提示 c- myc是 ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游靶基因。ERK通路是MAPK家族的經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[8-10]，在腫瘤細(xì)胞凋亡、分化、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。ERK包括ERK1和ERK2兩種異構(gòu)體，其活性形式是磷酸化ERK(p-ERK)，在受到如細(xì)胞因子、生長因子激素、絲裂原受體和缺氧等刺激時(shí)，ERK發(fā)生磷酸化，并從胞漿移位至細(xì)胞核作用于c-myc、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而誘發(fā)多種癌基因的相繼激活，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，在肝細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)[11]上調(diào)癌細(xì)胞內(nèi)Ras-ERK通路的磷酸化水平，癌基因 c -myc表 達(dá)增加，我們?cè)囼?yàn)結(jié)果再次證實(shí)了c-myc的表達(dá)受ERK的調(diào)控。Survivin對(duì) c- myc這 個(gè)癌基因在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平具有正向調(diào)控作用，而c-myc的表達(dá)受ERK的調(diào)控，故我們進(jìn)一步檢測(cè)了Survivin shRNA沉默下調(diào)Survivin后ERK磷酸化的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)p-ERK活化受到抑制，提示Survivin對(duì)c-myc的調(diào)控作用可能與ERK信號(hào)通路有關(guān)，ERK蛋白的活化狀態(tài)是ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵點(diǎn)，目前多種腫瘤藥物都是以信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶為靶點(diǎn)，從而阻斷其誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。Survivin作為多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游效應(yīng)分子[12-13]，其高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制，腫瘤細(xì)胞異常增殖，但其作為調(diào)控因子的研究并不多見，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)可以影響ERK磷酸化水平，提示在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，基因與信號(hào)通路的關(guān)系可能不單單是一種單向調(diào)節(jié)的作用，高表達(dá)的Survivin可能通過影響ERK磷酸化水平從而調(diào)節(jié)其下游靶基因 c-myc的 表達(dá)水平。基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)龐大、作用復(fù)雜的系統(tǒng)，我們的研究?jī)H僅證實(shí)了Survivin具有影響ERK磷酸化的作用，但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。