李 蓁， 張 帆， 蔡紅兵， 盧玉蘭

武漢大學(xué)中南醫(yī)院 婦瘤科 湖北省腫瘤醫(yī)學(xué)臨床研究中心 腫瘤生物學(xué)行為湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071

卵巢癌是婦科臨床常見的惡性腫瘤之一，該病發(fā)病隱匿，臨床癥狀不典型，確診時(shí)多數(shù)患者已發(fā)展至中晚期，經(jīng)手術(shù)或綜合療法治療后，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率均較高[1]。目前，卵巢癌臨床診斷和預(yù)后評估最常用的分子標(biāo)志物是血清糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)，預(yù)測卵巢癌的敏感度為80%左右[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是近年來的研究熱點(diǎn)，在腫瘤性疾病的病理研究中受到越來越多的重視[3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，同源盒基因反義轉(zhuǎn)錄RNA(homeobox transcript antisense RNA，HOTAIR)對婦科惡性腫瘤具有一定的診斷價(jià)值[4]。本研究旨在探討LncRNA- HOTAIR與卵巢癌術(shù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系及意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2014年5月至2016年5月武漢大學(xué)中南醫(yī)院收治的進(jìn)行手術(shù)治療的138例卵巢癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：初診患者，術(shù)前無放化療或手術(shù)史；擬行以手術(shù)為主的綜合治療策略；術(shù)后病理證實(shí)為卵巢上皮性癌；臨床和隨訪資料完整，隨訪時(shí)間≥20個(gè)月。本組患者年齡39～69歲，平均年齡(45.6±6.8)歲；國際婦產(chǎn)科協(xié)會分期：Ⅱa期10例，Ⅱb期11例，Ⅱc期9例，Ⅲa期25例，Ⅲb期29例，Ⅲc期44例，Ⅳ期10例；分化程度：高分化88例，中分化35例，低分化15例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方法 所有患者均行手術(shù)治療，主要是全子宮、附件及大網(wǎng)膜切除術(shù)聯(lián)合腹、盆腔腫瘤減滅術(shù)。其中，有31例同時(shí)行淋巴結(jié)清掃或活檢術(shù)。術(shù)后進(jìn)行4～8個(gè)療程的化療，主要化療方案為以鉑類為基礎(chǔ)的的綜合方案，其中，紫杉醇聯(lián)合奈達(dá)鉑49例，卡鉑聯(lián)合脂質(zhì)體多柔比星55例，卡鉑聯(lián)合紫杉醇34例。

1.3 預(yù)后評估方法 患者治療完成后2年內(nèi)每3個(gè)月入院復(fù)查1次，自第3年起每半年入院復(fù)查1次，不能入院復(fù)查患者電話回訪，記錄患者復(fù)發(fā)率和病死率，統(tǒng)計(jì)截止日期為2018年5月30日。

1.4 血清CA125測定方法 分別于術(shù)前和術(shù)后6個(gè)月抽取患者空腹肘靜脈血，室溫靜置40 min，4 000 r/min離心分離血清。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(上海羅氏，型號：Elecsys 2010)及其配套試劑盒測定CA125水平，陽性標(biāo)準(zhǔn)為血清CA125含量>35 U/ml。

1.5 LncRNA-HOTAIR測定方法 分別于術(shù)前和術(shù)后6個(gè)月抽取患者空腹肘靜脈血，采用全血總RNA快速提取試劑盒提取外周血總RNA，經(jīng)吸附柱純化后采用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)測定LncRNA-HOTAIR的mRNA表達(dá)水平。主要步驟：(1)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)生成cDNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，RR047A)，按照試劑盒要求配置體系，置于熒光定量PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為35℃×15 min，85℃×5 s，4℃保持，準(zhǔn)備擴(kuò)增。(2)所得RT產(chǎn)物自動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)，采用染料法熒光定量試劑盒(TAKARA，RR820A)，按照試劑盒配置體系，以U6為內(nèi)參，LncRNA-HOTAIR和U6分開測定，按照試劑盒要求配置體系，應(yīng)用溶解曲線觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的特異度，擴(kuò)增曲線計(jì)算mRNA表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)局與臨床資料 隨訪至2018年6月1日，138例患者共復(fù)發(fā)37例，復(fù)發(fā)率為26.8%(37/138)；病死21例，病死率為15.2%(21/138)，均死于癌復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)患者的病理分期較高，與未復(fù)發(fā)患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者臨床資料比較/例(百分率/%)

注：手術(shù)Ⅰ為全子宮、附件及大網(wǎng)膜切除術(shù)聯(lián)合腹、盆腔腫瘤減滅術(shù)；手術(shù)Ⅱ?yàn)槿訉m、附件及大網(wǎng)膜切除術(shù)聯(lián)合腹、盆腔腫瘤減滅術(shù)+淋巴結(jié)清掃或活檢術(shù)

2.2 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者外周血標(biāo)志物水平比較 術(shù)前、術(shù)后，復(fù)發(fā)組患者血清CA125陽性率、CA125水平及LncRNA-HOTAIR mRNA表達(dá)水平均高于未復(fù)發(fā)組，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者外周血標(biāo)志物水平比較

2.3 外周血標(biāo)志物對卵巢癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值 術(shù)前、術(shù)后的血清CA125水平及LncRNA-HOTAIR mRNA表達(dá)水平對卵巢癌術(shù)后復(fù)發(fā)均有預(yù)測價(jià)值，其ROC曲線見圖1。術(shù)前LncRNA-HOTAIR和CA125的最佳工作點(diǎn)分別為2.75和356.7 U/ml，術(shù)后最佳工作點(diǎn)分別為1.62和46.3 U/ml，其敏感度和特異度見表3。

3 討論

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄長度>200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。LncRNA-HOTAIR是一類典型的反義轉(zhuǎn)錄RNA，其主要功能在于通過反式作用沉默染色質(zhì)，對人類胚胎發(fā)育和器官構(gòu)建均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[5]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-HOTAIR可通過與PRC2的相互作用沉默部分抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[6]；在宮頸癌中，Li等[7]研究證實(shí)LncRNA-HOTAIR能夠通過miR-23b作用于絲裂原活化蛋白激酶通路，從而促進(jìn)宮頸癌的淋巴轉(zhuǎn)移；在子宮內(nèi)膜癌中，有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-HOTAIR還能夠調(diào)節(jié)某些抑癌基因的甲基化，并推測通過甲基化作用沉默某些抑癌基因及信號通路的表達(dá)，可能是其促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌淋巴轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一[8]。另有研究指出，LncRNA-HOTAIR不僅參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，還參與了腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥[9]。

圖1 術(shù)前、術(shù)后LncRNA-HOTAIR及CA125預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線

指標(biāo)曲線下面積P值95%可信區(qū)間敏感度特異度術(shù)前LncRNA-HOTAIR0.77900.682～0.8760.7300.721術(shù)前CA1250.83600.746～0.9260.7410.824術(shù)后LncRNA-HOTAIR0.84500.779～0.9110.6950.915術(shù)后CA1250.81500.743～0.8860.7140.703

目前，已有研究指出，LncRNA-HOTAIR能夠通過多種途徑介導(dǎo)卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展，但多數(shù)研究是針對癌組織樣本或癌細(xì)胞樣本的考察[10-11]，本研究重點(diǎn)分析外周血LncRNA-HOTAIR與卵巢癌術(shù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系及意義。本研究結(jié)果顯示，本組138例患者術(shù)后2～3年的復(fù)發(fā)率為26.8%，基本處于國內(nèi)報(bào)道范圍以內(nèi)。本研究對復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)患者的基本資料和治療方式進(jìn)行比較，除復(fù)發(fā)組的病理分期較高外，其他資料無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中，病理分期為Ⅳ期的患者復(fù)發(fā)率高達(dá)80%。這主要是因?yàn)棰羝诨颊咄呀?jīng)侵犯臨近或遠(yuǎn)端器官，腫瘤體積大，累及范圍廣，手術(shù)難度高，且術(shù)中腫瘤細(xì)胞脫落與定植的風(fēng)險(xiǎn)也高，已有研究證實(shí)，國際婦產(chǎn)科協(xié)會Ⅳ期為術(shù)后復(fù)發(fā)的高危因素[12]。CA125是目前診斷和評估卵巢癌病情的常規(guī)標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)患者CA125陽性率及整體水平均高于未復(fù)發(fā)患者，這與張艷麗等[13]研究報(bào)道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組外周血LncRNA-HOTAIR mRNA表達(dá)水平也高于未復(fù)發(fā)組，進(jìn)一步ROC曲線分析結(jié)果顯示，術(shù)前、術(shù)后的CA125和LncRNA-HOTAIR 對卵巢癌術(shù)后復(fù)發(fā)均有預(yù)測價(jià)值，且敏感度均達(dá)到了較好的水平?？紤]到多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測能提高生物標(biāo)志物的臨床診斷效能，LncRNA-HOTAIR不失為一種良好的輔助指標(biāo)。

綜上所述，外周血LncRNA-HOTAIR表達(dá)水平與卵巢癌術(shù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，可作為血清CA125的輔助指標(biāo)對術(shù)后復(fù)發(fā)做出預(yù)測。