李景毅， 郎宇璜， 陳鳳媛， 繆京豐

上海市第五人民醫(yī)院1.創(chuàng)傷急救中心；2.消化內科，上海 200240

重度創(chuàng)傷性腦損傷是神經外科常見急癥，具有較高的致死率和致殘率[1-2]。重度創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生后，機體多個器官可出現(xiàn)繼發(fā)性功能障礙，且互相影響，甚至出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征[3-5]。腸黏膜屏障損傷會繼發(fā)于嚴重創(chuàng)傷、感染、休克等，可導致腸道細菌和內毒素移位，激發(fā)炎癥反應，誘發(fā)和促進全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征[6-7]。骨橋蛋白是一種機體反應性蛋白，在特定的生理病理狀態(tài)下，由間葉組織細胞分泌到細胞外基質中，在骨代謝、傷口愈合、血管生成、腫瘤發(fā)生、炎癥免疫反應等方面發(fā)揮重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，多器官功能障礙綜合征患者的炎癥感染病理過程中，骨橋蛋白表達水平會顯著升高[9]。本研究主要通過建立大鼠重度創(chuàng)傷性腦損傷模型，研究骨橋蛋白在重度創(chuàng)傷性腦損傷后腸道應激性反應中的表達水平變化趨勢和在外周血中的表達特點，以及其與腸道通透性變化和部分炎性因子的相關性，從骨橋蛋白角度了解腸黏膜屏障應激性反應的免疫特點，為進一步研究重度創(chuàng)傷性腦損傷后腸黏膜損傷的機制和防治手段提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性SD大鼠24只，體質量200～250 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號碼：SCYK(滬)2013-0016。骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(美國R&D公司)，熒光異硫氰酸鹽葡聚糖(美國Sigma公司)；立體定位儀(美國WPI公司)，ALC-FP6液壓沖擊顱腦損傷儀、ALC-CED牙科鉆(上海奧爾科特生物科技有限公司)，H-600透射電子顯微鏡(日本日立公司)，CS-31光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及重度創(chuàng)傷性腦損傷模型建立 將大鼠隨機分入假手術組(n=6)和重度創(chuàng)傷性腦損傷組(n=18)。假手術組僅切開頭皮，開骨窗，不行液壓打擊。重度創(chuàng)傷性腦損傷組參照Dixon法建立大鼠重度創(chuàng)傷性腦損傷模型[10]：大鼠全身麻醉后，沿頭部正中線切開皮膚至骨膜，于前囟門后3.5 mm處開直徑約5.0 mm的骨窗，行液壓打擊，致傷能量為(173.68±10.23)kPa，然后用牙托粉封閉骨窗后縫合。按照術后1、3、5 d時間點，將重度創(chuàng)傷性腦損傷組分為傷后1 d組、傷后3 d組、傷后5 d組3個亞組，每組6只大鼠。

1.2.2 標本采集 于傷后1、3、5 d，分別將重度創(chuàng)傷性腦損傷大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內注射麻醉，剖開腦腔、胸腔及腹腔。取完整腦組織，分別以4.0%多聚甲醛固定，石蠟包埋；以2.5%戊二醛固定，EPON812包埋，制作組織標本；穿刺心臟、取血，離心分離血漿，-80℃冰箱凍存；截取回腸末段(距回盲部5 cm)組織，一部分以4%多聚甲醛溶液固定，制作組織蠟塊，另一部分以液氮罐凍存。

1.3 觀察指標

1.3.1 腦病理組織學觀察 腦組織蠟塊連續(xù)切片，HE染色，200倍光學顯微鏡下觀察腦組織病理學變化。同時，在透射電子顯微鏡下觀察神經元細胞和突觸的形態(tài)學變化。

1.3.2 腸病理組織學評價 腸組織蠟塊連續(xù)切片，HE染色，參照文獻[11]對小腸黏膜損傷程度進行病理學評分。評分標準：0分，黏膜正常；1分，絨毛頂部上皮下間隙增寬；2分，上皮層與固有層呈中度分離；3分，絨毛兩邊呈大量分離，并伴部分絨毛頂部破損；4分，絨毛大量破損，伴固有層毛細血管顯著顯露；5分，固有層呈破壞、潰瘍及出血。

1.3.3 腸道通透性檢測 參照文獻[12]，采用熒光異硫氰酸鹽葡聚糖示蹤法進行活體腸道通透性評價。經胃管灌入熒光異硫氰酸鹽葡聚糖 400 mg/g，4 h后取血標本，采用熒光分光光度儀測定熒光強度，激發(fā)光波長480 nm，發(fā)射光波長520 nm。

1.3.4 血漿中骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6表達水平檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定血漿中骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6的表達水平。

1.3.5 腸組織中骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6表達水平檢測 將凍存的小腸組織研磨，制作組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6的表達水平。

2 結果

假手術組腦組織血管和突觸泡正常。傷后1 d組大鼠腦組織血管周圍有空隙，神經元細胞有脫落現(xiàn)象，管腔面不清晰，內皮細胞胞漿腫脹，有空泡，部分突觸泡輕度擴張；傷后3 d組大鼠腦組織血管周圍出現(xiàn)大量空白區(qū)，血管壁變薄，突觸泡擴張，部分區(qū)域融在一起，形成大片空白區(qū)；傷后5 d組大鼠腦組織血管周圍出現(xiàn)大量空白區(qū)，血管壁變薄，突觸泡擴張，形成大片空白區(qū)。見圖1～2。重度創(chuàng)傷性腦損傷組大鼠的腸黏膜病理學評分和通透性，腸組織和血漿中骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6的表達水平均明顯高于假手術組，且隨著傷后時間的延長而上升，各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1～3。血漿骨橋蛋白表達與腸黏膜病理學評分、腸黏膜通透性、腫瘤壞死因子-α及白細胞介素-6的表達水平具有相關性(P<0.05)。

3 討論

腸黏膜不僅具有消化和吸收功能，還具有防御性屏障功能。腸黏膜屏障分為機械屏障、生物屏障、化學屏障及免疫屏障四部分，這四部分之間互相關聯(lián)[13]。腸道內貯存著大量的細菌和內毒素，當發(fā)生重大損傷，可誘發(fā)腸黏膜屏障功能損傷，導致細菌、內毒素等突破腸黏膜屏障，進入門靜脈和淋巴系統(tǒng)，啟動全身炎癥反應，甚至發(fā)展為全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征[14]。重度創(chuàng)傷性腦損傷繼發(fā)腸黏膜屏障損傷的機制尚未完全闡明，多數(shù)學者認為重度創(chuàng)傷性腦損傷患者因顱內壓升高，引起自主神經系統(tǒng)功能紊亂，導致器官血管收縮，誘發(fā)組織缺血缺氧；同時，因神經-內分泌-內分泌網絡調節(jié)紊亂而出現(xiàn)過度炎癥反應[15]。腸道對缺血-再灌注損傷極為敏感，也是過度炎癥反應先受累的器官[16]。在創(chuàng)傷后多器官功能障礙綜合征患者中，腸屏障功能受損程度與機體免疫抑制程度、病情嚴重程度呈正相關，是不良預后的危險因素[17-18]。有研究報道，大鼠在重度創(chuàng)傷性腦損傷后3、72 h，腸黏膜通透性出現(xiàn)兩個峰值：第1個峰值可能與腸道缺血-再灌注損傷有關；第2個峰值可能與腸黏膜上皮細胞凋亡或壞死，絨毛破損，形成局灶黏膜潰瘍有關[19-21]。

圖1 各組光學顯微鏡下腦組織病理學觀察(HE染色×200)

圖2 各組透射電子顯微鏡下腦組織病理學觀察(HE染色×6 000)

組別病理學評分/分熒光異硫氰酸鹽葡聚糖/μg·ml-1假手術組0.38±0.1546.73±9.12傷后1 d組3.34±0.47①105.12±26.74①傷后3 d組5.12±0.85①②565.28±74.35①②傷后5 d組5.75±0.89①②③638.67±85.49①②③

注：與假手術組比較，①P<0.05；與傷后1 d組比較，②P<0.05；與傷后3 d組比較，③P<0.05

表2 各組腸組織中骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6表達水平比較

注：與假手術組比較，①P<0.05；與傷后1 d組比較，②P<0.05；與傷后3 d組比較，③P<0.05

表3 各組血漿中骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6表達水平比較

注：與假手術組比較，①P<0.05；與傷后1 d組比較，②P<0.05；與傷后3 d組比較，③P<0.05

骨橋蛋白是一種分泌型糖基化的細胞外基質蛋白，又被稱為早期T淋巴細胞活化因子。骨橋蛋白在正常情況下表達甚微；但在損傷、感染、低氧等誘導因素作用下，巨噬細胞、平滑肌細胞、T淋巴細胞、成纖維細胞等都可以早期大量表達骨橋蛋白，調節(jié)細胞的趨化和粘附、細胞因子的表達、免疫應答及炎癥反應等，參與機體炎癥反應，發(fā)揮強效促炎作用[22-26]。本研究中，重度創(chuàng)傷性腦損傷組大鼠的腸黏膜病理學評分和通透性，腸組織和血漿中骨橋蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6的表達水平均明顯高于假手術組，且隨著傷后時間的延長而上升，各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；血漿骨橋蛋白表達與腸黏膜病理學評分、腸黏膜通透性、腫瘤壞死因子-α及白細胞介素-6的表達水平具有相關性(P<0.05)。以上結果提示，骨橋蛋白可能參與大鼠重度創(chuàng)傷性腦損傷后腸黏膜屏障損傷的病理過程。因本研究為動物實驗且樣本量較少，相關結論尚需進一步研究驗證。

綜上所述，骨橋蛋白在大鼠重度創(chuàng)傷性腦損傷后腸黏膜屏障損傷的病理過程中發(fā)揮重要作用，是評價腸道通透性的一個新的潛在指標。