雷榮 李娟 余天 張帆

1.武漢愛爾眼科醫(yī)院淚道科，湖北 武漢 430063；

2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院干細(xì)胞中心，湖北 武漢 430022；

3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430030

葡萄膜黑色素瘤是人眼內(nèi)腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一［1］，90%來源于人眼脈絡(luò)膜［2］。隨著近年來診療水平的不斷提高，以保留眼球為前提的綜合治療已取得顯著的療效，其中放射治療是葡萄膜黑色素瘤最常用的方法之一［3］。近年發(fā)現(xiàn)的Omi/HtrA2是存在于線粒體膜間隙的前凋亡分子，在促凋亡信號誘導(dǎo)下，Omi/HtrA2由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，并通過抑制凋亡蛋白抑制因子家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)、活化半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶途徑促凋亡［4］。早期生長反應(yīng)基因1(early growth response-1，Egr-1)的調(diào)控序列中一段特定結(jié)構(gòu)可感受細(xì)胞內(nèi)外的理化刺激如自由基、電離輻射等［5］，繼而誘導(dǎo)下游基因表達(dá)。我們通過脂質(zhì)體將pEgr1-HtrA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系OCM-1，結(jié)合放射線干預(yù)(radiation treatment，RT)，誘導(dǎo)Omi/HtrA2表達(dá)，探討通過誘導(dǎo)基因殺傷治療葡萄膜黑色素瘤的可能。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

pIRES-Egr1(pEgr1)和pEgr1-HtrA2質(zhì)粒根據(jù)孫教授等［6］的研究設(shè)計。pEgr1、pEgr1-H trA2和pCMV-HtrA2質(zhì)粒由武漢晶賽公司構(gòu)建、純化并鑒定。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人眼葡萄膜黑色素瘤OCM-1細(xì)胞本實驗室常規(guī)保存，培養(yǎng)條件：DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，添加10%胎牛血清(美國Hyclone公司)，100 kU/L青霉素-G，100 mg/L鏈霉素(美國Gibco公司)，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時換成OPTI-MEM培養(yǎng)基，并用LipofectamineTM2000 (美國Invitrogen公司)分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEgr1、pCMV-HtrA2和pEgr1-HtrA2，轉(zhuǎn)染步驟按說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染4 h后換液，改用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h用于相關(guān)指標(biāo)檢測。在濃度為600 μg/mL G418中培養(yǎng)篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒。

1.3 放射條件

采用西門子直線加速器的X射線照射(6 MeV X射線，距離100 cm，2 Gy/min)。

轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，給予不同劑量的放射照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于相關(guān)指標(biāo)檢測。移植瘤的局部給予放射線照射，隔日1次，共3次。

1.4 實時定量PCR

用TRIzol(美國Invitrogen公司)法提取總RNA。將100~500 ng總RNA用cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時定量PCR在LightCycler(Roche)機(jī)器上運行，并用SYBR Green Real-time PCR Master Mix-Plus(日本TOYOBO公司)試劑盒。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。分別擴(kuò)增HtrA2和內(nèi)參GAPDH基因。HtrA2的上游引物為5’-CTAGCTAGCGCC ACCATGGCTGCGCCGAGGGC-3’，下游引物為5’-CGACGCGTTCATTCTGTGAC C T C A G G G G T C A C A-3’。G A P D H的 上 游 引 物 為5 ’ - G A A G G T G A A G G T C G G A G T C-3’，下游引物為5’-G A A G ATGGTGATGGGATTTC-3’。以GAPDH基因作為參照，利用ΔΔCT法計算相對變化量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測HtrA2蛋白表達(dá)量

收集各組細(xì)胞用R I PA 裂解液(加拿大ProMab生物公司)提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。分別將提取的各個樣品的50 μg蛋白行8%SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜，封閉后，分別加入Omi/HtrA2小鼠抗人抗體(美國Abcam公司，1∶500)、β-actin克隆抗體(美國Abcam公司，1∶333)、溫育、洗滌、添加二抗(美國KPL公司，1∶3 000)。底物發(fā)光試劑盒SuperSignal蛋白質(zhì)檢測試劑盒購自Pierce公司。以β-actin作為參照，相對計算條帶的灰度值。實驗至少重復(fù)3次。

1.6 克隆形成實驗

各組呈對數(shù)生長的單層細(xì)胞分別予以0、2、4、6、8、10 Gy劑量的X線照射。將各組照射后的細(xì)胞以適當(dāng)數(shù)量接種到培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)2周后，固定，結(jié)晶紫染色細(xì)胞。在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)＞50個細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI(美國Becton公司)雙標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。胰蛋白酶消化法收集各組細(xì)胞，80%乙醇4 ℃過夜。染色標(biāo)記根據(jù)說明書步驟進(jìn)行后立即上流式細(xì)胞儀檢測。采用Cellq uest軟件分析。實驗重復(fù)3次。

1.8 動物實驗

OCM-1細(xì)胞(含1×107細(xì)胞的0.2 mL無菌0.9%NaCl溶液懸液)注射入裸小鼠的右后肢皮下制作移植瘤模型，腫瘤體積達(dá)300 mm3的小鼠用于下一步實驗。將移植瘤模型小鼠分為對照組、放射組、基因組以及基因放射組，每組10只?；蚪M和基因放射組移植瘤內(nèi)注射pEgr1和pEgr1-HtrA2質(zhì)粒(100 μL含20 μg質(zhì)粒和40 μg LipofectamineTM2000的混合物)。放射組和基因放射組小鼠局部給予8 Gy和4 Gy照射，隔日1次，共3次。質(zhì)粒分別從4個方向注入腫塊，防止泄漏。小鼠于無菌環(huán)境下飼養(yǎng)。腫瘤體積運用公式0.54×長(mm)×寬(mm)×高(mm)，電腦斷層掃描測量后計算。腫瘤體積每周測2次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同X-ray劑量下HtrA2基因表達(dá)情況

將轉(zhuǎn)染pEgr1、pEgr1-HtrA2或pCMV-HtrA2質(zhì)粒的各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，給予0、2、4、8和12 Gy不同劑量的放射照射。24 h后檢測HtrA2 mRNA表達(dá)。隨著放射劑量的增加，pEgr1-HtrA2組HtrA2 mRNA表達(dá)較照射前增加，呈劑量依耐性，4 Gy時顯著增加，在8 Gy時達(dá)到最高值，較照射前增加15倍(P<0.05)，pCMVHtrA2組HtrA2 mRNA表達(dá)較照射前輕度下降，與放射劑量無明顯關(guān)系，pEgr1組HtrA2 mRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05，圖1A)。Western blot檢測8 Gy照射后的各組細(xì)胞HtrA2蛋白表達(dá)情況。pEgr1-HtrA2組HtrA2蛋白較照射前明顯增加(P<0.05)，pCMV-HtrA2組HtrA2蛋白較照射前無明顯變化(P<0.05，圖1B)。結(jié)果顯示放射線能夠有效啟動Egr1以及其下游的基因表達(dá)。

2.2 HtrA2基因?qū)Ψ派涿舾行缘挠绊?/h3>

檢測轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的OCM-1細(xì)胞在0、2、4、6、8和10 Gy不同劑量X射線照射后的克隆數(shù)，計算各組克隆形成率?？梢妏Egr1-HtrA2組和pCMV-HtrA2組隨放射劑量增加克隆形成率下降，且均較pEgr1組低(P<0.05，圖2)。說明轉(zhuǎn)染pEgr1-HtrA2質(zhì)粒后可增強(qiáng)OCM-1細(xì)胞放射敏感性。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

將轉(zhuǎn)染pEgr1、pEgr1-HtrA2或pCMV-HtrA2質(zhì)粒的各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h或給予8 Gy放射照射后培養(yǎng)24 h，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀凋亡檢測。pEgr1-HtrA2聯(lián)合放射組和pCMVHtrA2聯(lián)合放射組細(xì)胞凋亡率分別為(40.2±5.9)%和(37.7±6.0)%，較pEgr1、pEgr1-HtrA2及pEgr1聯(lián)合放射組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。pCMV-HtrA2組與pCMV-HtrA2聯(lián)合放射組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖1 qRT-PCR和Western blot法檢測HtrA2 mRNA和蛋白表達(dá)Fig.1 Detection of mRNA and protein expression of HtrA2 by qRT-PCR and Western blot

圖2 克隆形成實驗檢測細(xì)胞生存率Fig.2 Clonogenic survival after various doses of irradiation exposure

2.4 動物實驗

質(zhì)粒分別注射入移植瘤模型局部后給予8或4 Gy的放射線照射，隔日1次，共3次，總劑量分別達(dá)24和12 Gy。定期記錄腫瘤體積。pEgr1-HtrA2聯(lián)合放射組第10天起腫瘤開始縮小，更長時間觀察未見腫瘤體積增大，在40 d時有5只小鼠的移植瘤縮小至觸摸不清，無法測量，與其他組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4A)。pEgr1和pEgr1-HtrA2組移植瘤快速生長，pEgr1聯(lián)合放射和單純放射組腫瘤早期暫時縮小，但從第20天開始迅速生長。

在pEgr1-HtrA2聯(lián)合4 Gy放射組長時間觀察未見移植瘤的體積增大，也未見腫瘤破潰、出血、結(jié)痂、死亡。30 d時1只實驗小鼠的移植瘤縮小至觸摸不清。在單純4 Gy照射組，腫瘤體積繼續(xù)增大(圖4B)。說明較低劑量放射線結(jié)合基因能夠達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡Fig.3 Detection of the apoptosis by fl ow cytometry

圖4 動物實驗中pEgr1-HtrA2聯(lián)合放射對葡萄膜黑色素瘤的影響Fig.4 Effects of pEgr1-HtrA2 gene therapy combined with radiation in vivo

3 討 論

腫瘤治療的腫瘤基因-放射治療是將經(jīng)射線誘導(dǎo)表達(dá)并對腫瘤具有殺傷作用的基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，然后對腫瘤實施放療，同時誘導(dǎo)基因表達(dá)，通過射線和基因的雙重作用殺傷腫瘤，為解決腫瘤放療的不良反應(yīng)開辟了新途徑［7］。Egr-1正是含有此類調(diào)控序列的基因的典型代表［8-9］，屬于立早基因家族，定位于5q31，mRNA全長310 bp，編碼543個氨基酸，其序列中含有多個保守的CarG結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可感受細(xì)胞內(nèi)外的理化刺激如自由基、電離輻射等，繼而誘導(dǎo)下游基因表達(dá)。Tsurushima等［10］將凋亡因子caspase-8與Egr-1啟動子構(gòu)造成一完整質(zhì)粒后用于治療惡性腦膠質(zhì)瘤取得了滿意的療效，且效果可在時間和空間上受放射線調(diào)控。這種可控的基因放射治療使得放療的不良反應(yīng)進(jìn)一步降低，安全性進(jìn)一步提高。

HtrA2是近年發(fā)現(xiàn)的一種前凋亡分子，在細(xì)胞內(nèi)具有雙重作用：①該分子存在于線粒體中并參與線粒體的正常生理代謝；②在外界刺激條件下，它從線粒體釋放出來參與并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。其途徑包括：能與IAPs特異性結(jié)合，解除IAPs對半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的阻抑而激發(fā)凋亡，依賴其本身的蛋白激酶活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此外，HtrA2還參與腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡［12］和腫瘤壞死［13］。

本研究選用這種前凋亡分子與Egr-1啟動子成功構(gòu)建pEgr1-HtrA2質(zhì)粒，并與常規(guī)啟動子pCMV-HtrA2質(zhì)粒和空白質(zhì)粒pEgr1對比。分別轉(zhuǎn)染了上述3種質(zhì)粒的OCM-1細(xì)胞在接受0、2、4、8、12 Gy劑量的放射線后，pEgr1-HtrA2組HtrA2 mRNA表達(dá)在8 Gy時達(dá)到高峰，我們認(rèn)為可能Egr-1啟動子在8 Gy時已達(dá)到最大效率，在8 Gy前HtrA2表達(dá)隨放射劑量增加而增高，而pCMV-HtrA2組并無劑量依賴性。

總之，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HtrA2前凋亡因子可在放射線作用下抑制葡萄膜黑色素瘤OCM-1細(xì)胞的生長，并在動物實驗中取得了滿意的效果。由Egr-1啟動子構(gòu)建的pEgr1-HtrA2質(zhì)粒依賴放射線調(diào)控，可減少放射線劑量，增強(qiáng)放射敏感性，同時也提高了局部放療的安全性。

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