羅靜 徐美青 郭明發(fā) 魏大中 柳常青 孫翔翔

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科，安徽 合肥 230001

肺癌是目前我國(guó)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，約80%診斷為非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)。手術(shù)是Ⅰ～Ⅱ期及部分ⅢA期NSCLC患者主要的治療方法之一，雖術(shù)后予以輔助化療，但生存率改善不佳，有研究表明5年生存率僅改善5%［1-2］，近年來(lái)，隨著肺癌個(gè)體治療的發(fā)展，為肺癌患者選擇合適的化療方案，從而提高療效，延長(zhǎng)生存期。DNA切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1 (excision repair cross complementation group l，ERCC1)蛋白在DNA修復(fù)途徑中起關(guān)鍵作用，其高表達(dá)與鉑類(lèi)藥物的耐藥性相關(guān)。以往研究中常采用抗體8F1檢測(cè)ERCC1的表達(dá)，研究結(jié)果有正向的，也有反向的［3-4］。近來(lái)發(fā)現(xiàn)ERCC1抗體8F1有非特異性，同時(shí)也研制了ERCC1的新抗體4F9［5-6］。但該新抗體用于腫瘤臨床標(biāo)本的檢測(cè)進(jìn)而指導(dǎo)鉑類(lèi)用藥的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為了明確ERCC1新抗體4F9在NSCLC患者鉑類(lèi)用藥的指導(dǎo)作用，本研究采用ERCC1新抗體4F9免疫組化方法檢測(cè)ERCC1在NSCLC組織中的表達(dá)，分析其與NSCLC臨床和病理特征的關(guān)系，以及鉑類(lèi)化療藥物對(duì)患者的療效和生存期的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2010年6月—2011年1月安徽省立醫(yī)院胸外科手術(shù)治療且術(shù)后行輔助化療的Ⅰ～Ⅲ期NSCLC患者72例，其中男性42例，女性30例，年齡40～72歲；鱗癌38例，腺癌34例；臨床Ⅰ期為30例，Ⅱ期為28例，Ⅲ期為14例；淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移為32例，有轉(zhuǎn)移為40例。采用GP方案(吉西他濱1 g/m2第1、8天+卡鉑500 mg/m2)者24例，采用TP方案(多西他賽100 mg/m2+卡鉑500 mg/m2)者32例，采用NP方案(長(zhǎng)春瑞濱25 mg/m2第1、5天+卡鉑500 mg/m2)者16例，連續(xù)4～6個(gè)周期?；颊咦允中g(shù)后開(kāi)始隨訪，末次隨訪時(shí)間至2013年7月30日。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

取上述72例患者手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)石蠟包埋，4 μm切片；經(jīng)二甲苯，無(wú)水酒精脫蠟，水化組織切片；抗原修復(fù)暴露抗原決定族；3%H2O2處理內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min；封閉非特異，PBS洗3次，每次3 min；一抗ERCC1抗體克隆4F9(購(gòu)自北京中衫公司，1∶100稀釋)，放入濕盒中于37 ℃ 1 h或4 ℃過(guò)夜溫育，PBS洗3次，每次3 min；二抗(購(gòu)自福州邁新公司，按說(shuō)明書(shū)稀釋)溫育30 min，PBS洗3 min×5次；SP(購(gòu)自福州邁新公司，按說(shuō)明書(shū)稀釋)37 ℃溫育30 min；DAB顯色系統(tǒng)顯色，加滴蘇木素染液復(fù)染后脫水、封片。

判定標(biāo)準(zhǔn)：采用組織化學(xué)評(píng)分法，采取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性比例，腫瘤細(xì)胞表達(dá)數(shù)1%～9%計(jì)分0.1；>9%～49%計(jì)分0.5；>49%計(jì)分1，并根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度記分(0、1、2、3分)，二者分?jǐn)?shù)相乘為該標(biāo)本的最終得分?！?為高表達(dá)，<1為低表達(dá)。

1.3 預(yù)后評(píng)價(jià)

化療療效按RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，計(jì)算化療有效率。計(jì)算中位生存期及2年生存率，生存期為治療開(kāi)始至死亡或隨訪結(jié)束的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用Log-rank比較生存率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ERCC1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，ERCC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的NSCLC細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1)，72例NSCLC患者中ERCC1高表達(dá)為55.5%(40/72)。χ2檢驗(yàn)顯示，ERCC1表達(dá)與年齡、性別、期別、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

圖1 免疫組化檢測(cè)ERCC1在NSCLC中表達(dá)Fig. 1 ERCC1 expression detected by immunohistochemistry in NSCLC(DAB,×200)

表1 ERCC1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 Tab. 1 Correlation between the expression of ERCC1 with the clinicopathological characteristics of NSCLC

2.2 ERCC1的化療有效率

ERCC1高表達(dá)患者的化療有效率為37.5%，低表達(dá)者為62.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036，表2)。

2.3 ERCC1表達(dá)與生存期之間的關(guān)系

在40例ERCC1高表達(dá)患者中，中位總生存期為18.4個(gè)月，2年生存率為37.5%，32例ERCC1低表達(dá)的患者中，中位總生存期為22.9個(gè)月，2年生存率為46.9%，ERCC1低表達(dá)患者中位總生存期明顯長(zhǎng)于ERCC1高表達(dá)患者(P=0.046，圖2)。Ⅰ期ERCC1高表達(dá)和低表達(dá)患者的中位生存期分別是32.4個(gè)月和31.1個(gè)月，Ⅱ期ERCC1低表達(dá)患者和高表達(dá)患者的中位生存期分別是24.6個(gè)月和21.5個(gè)月，Ⅲ期ERCC1低表達(dá)患者和高表達(dá)患者的中位生存期分別是18.4個(gè)月和14.3個(gè)月，Ⅱ期和Ⅲ期ERCC1陰性中接受鉑類(lèi)藥物化療的患者的中位生存期明顯長(zhǎng)于陽(yáng)性患者。

表2 ERCC1的表達(dá)與化療有效率Tab. 2 The Chemotherapy effi ciency related with ERCC1 expression

圖2 ERCC1表達(dá)與總體生存期的關(guān)系Fig. 2 Kaplan-Meier plot of overall survival of NSCLC according to ERCC1 expression

3 討 論

目前肺癌術(shù)后治療以化療為主，因患者個(gè)體間的差異、分子病理類(lèi)型的不同，肺癌患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療敏感性差異較大。因此近年來(lái)提出了針對(duì)不同患者進(jìn)行個(gè)體化治療的概念。通過(guò)檢測(cè)藥物靶標(biāo)基因表達(dá)，制定個(gè)體化治療方案，從而提高化療效果，并判定預(yù)后。

ERCC1位于染色體l9ql3.2-13.3，全長(zhǎng)15 kb，含l0個(gè)外顯子，被轉(zhuǎn)錄加工為1.0 kb mRNA和1.1 kb mRNA，僅后者編碼含297個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，是首個(gè)克隆的DNA損傷修復(fù)基因［7］，是DNA損傷修復(fù)途徑中最主要的基因之一，具有損傷識(shí)別和切除5’端的雙重作用，在核苷酸切除修復(fù)中起到限速或調(diào)節(jié)的重要作用，是DNA修復(fù)的一個(gè)重要途徑。鉑類(lèi)藥物抗腫瘤作用的主要靶點(diǎn)為DNA，其細(xì)胞毒性主要在于與細(xì)胞核DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，影響DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致其致命損傷。ERCC1作為核苷酸切除修復(fù)的限速酶參與DNA的修復(fù)并且有可能作為使用鉑類(lèi)化療藥的預(yù)測(cè)的標(biāo)志物［8］，目前針對(duì)NSCLC的一線化療方案是以鉑類(lèi)為主的聯(lián)合化療。Simon等［3］和Sarrier等［9］根據(jù)ERCC1表達(dá)水平預(yù)測(cè)鉑類(lèi)的療效，結(jié)果表明ERCC1低表達(dá)者用鉑類(lèi)治療，ERCC1高表達(dá)者用非鉑類(lèi)治療，可以提高NSCLC治療的有效率。Cobo等［10］的研究是第一次根據(jù)ERCC1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行選擇性應(yīng)用鉑類(lèi)藥物的Ⅲ期對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果提示，依據(jù)ERCC1 mRNA表達(dá)水平對(duì)順鉑進(jìn)行選擇性用藥好于非選擇順鉑/多西他賽的傳統(tǒng)治療，實(shí)驗(yàn)組客觀緩解率、無(wú)進(jìn)展生存期均高于對(duì)照組。但也有相反的研究結(jié)果，Bepler等［4］報(bào)道了依據(jù)ERCC1和RRM1表達(dá)水平選擇用藥的Ⅲ期前瞻性研究結(jié)果，檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)組(根據(jù)檢測(cè)用藥)與無(wú)檢測(cè)的對(duì)照組(用吉西他濱/卡鉑方案)在無(wú)病生存期上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但進(jìn)一步分析卻發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，ERCC1/RRM1均為表達(dá)低的患者都用了吉西他濱/卡鉑治療在無(wú)病生存期上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些患者無(wú)論是分在實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，其無(wú)病生存期理應(yīng)沒(méi)有差異。因?yàn)槠銭RCC1/RRM1均為表達(dá)低、且均使用了吉西他濱/卡鉑治療，可以將他們看作是實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)對(duì)照?；诒臼菬o(wú)差異的內(nèi)對(duì)照卻出現(xiàn)了有差異的情況，筆者認(rèn)為該結(jié)果(檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)組與無(wú)檢測(cè)的對(duì)照組在無(wú)病生存期上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)是假陰性，并分析了造成此結(jié)果的原因：①多單位間在收集標(biāo)本和處理標(biāo)本的差異；②所用的檢測(cè)ERCC1的抗體8F1存在問(wèn)題；③以往多采用批量處理標(biāo)本，而該研究采用即時(shí)處理標(biāo)本，也可造成結(jié)果的差異。

已發(fā)現(xiàn)ERCC1抗體8F1存在非特異性，除了ERCC1蛋白外，還識(shí)別細(xì)胞核膜蛋白PCYT1A［5-6］。為解決這一問(wèn)題，有研究者制備了ERCC1的新抗體，4F9是其中之一［6］。但4F9應(yīng)用于腫瘤臨床標(biāo)本的研究鮮見(jiàn)報(bào)道［5］。本研究采用ERCC1新抗體4F9免疫組化方法檢測(cè)ERCC1在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)，分析其與NSCLC臨床和病理特征的關(guān)系，以及對(duì)患者鉑類(lèi)化療療效和生存期的影響。發(fā)現(xiàn)ERCC1蛋白低表達(dá)的患者中位生存期及2年生存率明顯好于高表達(dá)者(P<0.05)，表明ERCC1新抗體4F9免疫組化檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)鉑類(lèi)化療療效的可行性。

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