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(1.重慶市第十三人民醫(yī)院神內(nèi)老年科，重慶 400053；2.重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400032)

老齡化問(wèn)題日趨嚴(yán)重，成為社會(huì)科學(xué)與自然科學(xué)共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。干細(xì)胞衰老學(xué)說(shuō)是當(dāng)今闡釋衰老理論和老年性疾病發(fā)生與發(fā)展的最新學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為人體衰老就是其干細(xì)胞衰老所致。我課題組既往實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明[1-11]，小鼠造血干細(xì)胞隨年齡增加或者周?chē)h(huán)境變化及應(yīng)激中出現(xiàn)衰老，且呈現(xiàn)出一定變化規(guī)律。與小鼠類(lèi)似，人類(lèi)的造血作用隨年齡變化正常情況下可維持一種常態(tài)，但在周?chē)h(huán)境變化及應(yīng)激中可受到損傷，例如出血或癌癥化療的副作用導(dǎo)致造血干細(xì)胞被牽連,進(jìn)而導(dǎo)致與骨髓發(fā)育不良和惡性腫瘤有關(guān)的血液疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，說(shuō)明人類(lèi)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSC)也可能隨老化而受損[12-13]。我們?cè)诖搜芯扛缓琀SC和HPC的人CD34+細(xì)胞，希望通過(guò)觀察不同年齡組人類(lèi)造血干細(xì)胞與年齡相關(guān)的衰老變化特點(diǎn)，同小鼠數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，尋求干預(yù)人類(lèi)HSC衰老的最佳干預(yù)時(shí)間，達(dá)到對(duì)一系列造血疾患的預(yù)防或治療的目的。本課題組既往實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明[1-11]，一些天然藥物如人參皂苷Rg1及當(dāng)歸多糖可以通過(guò)雙向調(diào)節(jié)，抑制正常造血干細(xì)胞衰老，而對(duì)腫瘤干細(xì)胞則促進(jìn)其衰老及凋亡，起到預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用。但何時(shí)為干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)，希望通過(guò)本研究得到一點(diǎn)啟示。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與分組

由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科骨穿室提供正常人骨髓9例，將其分為青年組3例(女性31歲、男性26歲、男28歲)、中年組3例(男性59歲、男性57歲、女性52歲)和老年組3例(男性70歲、男性70歲、女性62歲)。

1.2 主要藥品與試劑

Human Anti-CD34 MicroBead Kit(FITC)(NO.130046703)，Mini MACS磁珠分選系統(tǒng)，MS磁珠分離柱，緩沖液(德國(guó)美天旎 Biotech公司)； 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(C0602，碧云天生物技術(shù)有限公司)，人干細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用混合培養(yǎng)基(Stem cell USA)，紅細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)。Ficoll分離液(天津?yàn)笊锕?。臺(tái)盼藍(lán)染液(C0011碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 免疫磁珠分離純化人骨髓CD34+HSC/HPC及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定純度腰椎穿刺獲取各年齡組人骨髓，置于抗凝管中，上下反復(fù)顛倒混勻，置于冰盒里，將骨髓用生理鹽水洗滌2次，移入離心管，離心后，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液置于4 ℃冰箱5 min，生理鹽水洗滌，參照說(shuō)明書(shū)，分離采集骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNCs)，離心后用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。取BMNCs 1×108個(gè)細(xì)胞加入100 μL Fcr blocking reagent、100 μL CD34 microbeads和300 μL Buffer，輕輕吹打混勻后4 ℃避光孵育30 min。將MS分選柱置于分離器磁場(chǎng)中，用干細(xì)胞專(zhuān)用buffer 沖洗MS柱2次。用一次性巴氏管將孵好抗體的細(xì)胞緩緩加到MS分選柱中，即將流盡后加1 mL buffer沖洗2次，向MS柱中加入1 mL buffer，用美天旎MS分選柱配套的活塞迅速推出柱子里的細(xì)胞，推出的細(xì)胞即為實(shí)驗(yàn)需要的人骨髓CD34+HSC/HPC。分別取MACS 分選前已標(biāo)記MNCs和分選后陽(yáng)性細(xì)胞1×106個(gè)，2 mL PBS 洗滌離心，使用流式細(xì)胞儀FACS Vantage SE ( 美國(guó)BD 公司) 檢測(cè)。每個(gè)樣品分析細(xì)胞數(shù)不少于2×104個(gè)細(xì)胞，用PC-LysysⅡ軟件在VAX3300 微機(jī)上進(jìn)行分析。計(jì)算磁珠分選前后CD34+細(xì)胞百分比[1]。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的存活率

取CD34+HSC/HPC懸液每組各90 μL，加入臺(tái)盼藍(lán)染液(4 g/L)10 μL，染色后靜置3 min計(jì)數(shù)，通過(guò)顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行觀察及計(jì)數(shù)，透明不著色細(xì)胞為活細(xì)胞，著色脹大并染為淡藍(lán)色的為死細(xì)胞，按下列公式計(jì)算活細(xì)胞率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.5 各年齡組CD34+HSC/HPC衰老相關(guān)β-半乳糖

苷酶(SA-β-gal)染色取各組人骨髓CD34+HSC/HPC 1×105個(gè)， 參照細(xì)胞衰老β半乳糖苷酶染色試劑盒說(shuō)明書(shū)方法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色。倒置相差顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.6 各年齡組CD34+HSC/HPC形成造血干/祖細(xì)胞

混合集落(CFU-Mix)能力比較在離心管中收集各年齡組人CD34+造血干/祖細(xì)胞各4×104個(gè)，每組各加入1 mL干細(xì)胞混合集落專(zhuān)用培養(yǎng)基，用大號(hào)槍頭輕輕混勻，不能有氣泡，輕輕加到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.5 mL，每天用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)到第7天時(shí)計(jì)數(shù)各組混合集落數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫磁性分選前后CD34+HSC/HPC純度比較

MACS分離純化后較分選前CD34+HSC/HPC純度明顯增加(圖1)，說(shuō)明我們使用的分離純化方法安全有效[1]。

2.2 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的存活率結(jié)果

各年齡組人骨髓CD34+造血干/祖細(xì)胞存活率均可達(dá)到99%以上，青年組(99.48±0.35)%，中年組(99.52±0.14)%，老年組(99.61±0.32)%。3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明我們分離的細(xì)胞存活率高，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 各年齡組人CD34+HSC/HPC衰老變化

取各組CD34+HSC/HPC，通過(guò)SA-β-半乳糖苷酶染色后陽(yáng)性細(xì)胞為藍(lán)色，細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)染顆粒；陰性細(xì)胞未著色青年組、中年組和老年組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸升高(圖2)，分別為(7.67±2.7)%、(66.3±4.7)%和(82.0±6.0)%。說(shuō)明人CD34+造血干/祖細(xì)胞的SA-β-gal染色陽(yáng)性率出現(xiàn)明顯的隨增齡變化趨勢(shì)。

a:磁珠分選前；b:磁珠分選后

*：與青年組比較，P<0.05

2.4 CD34+HSC/HPC混合集落形成能力比較

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，健康人類(lèi)從青年到中年再到老年，CD34+HSC/HPC形成的CFU-Mix數(shù)量及其中細(xì)胞數(shù)逐漸減少，分別為(8.3±0.7)%、(6.3±0.7)%和(1.3±0.7)%，同年齡呈正相關(guān)(圖3)。說(shuō)明隨年齡增加，人骨髓CD34+造血干/祖細(xì)胞增殖分化能力逐漸下降，與其衰老的結(jié)果呈正相關(guān)。

*：與青年組比較，P<0.05

3 討論

有越來(lái)越多的證據(jù)表明，衰老會(huì)誘導(dǎo)分子途徑的變化，從而加速干細(xì)胞和祖細(xì)胞突變的起始和/或克隆優(yōu)勢(shì)。老化相關(guān)的干細(xì)胞和祖細(xì)胞突變的積累與組織維持和癌癥抑制失敗之間的緊密聯(lián)系表明這些因素之間的因果關(guān)系[13-14]。除了此處討論的細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制之外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞外的影響因素影響干細(xì)胞的維持以及可能在衰老過(guò)程中選擇突變干細(xì)胞和祖細(xì)胞。外部的影響因素包括老化相關(guān)的干細(xì)胞生態(tài)位缺陷，全身/血液循環(huán)環(huán)境改變[15-16]，干細(xì)胞與祖細(xì)胞增殖競(jìng)爭(zhēng)變化[17]，炎癥反應(yīng)和受損細(xì)胞免疫監(jiān)視缺陷等[18-19]。細(xì)胞和分子機(jī)制的相互作用的描述促成了老齡化背景下干細(xì)胞和祖細(xì)胞突變的啟動(dòng)和選擇，這無(wú)疑將有助于改善老化相關(guān)的器官功能障礙和癌癥早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)防和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

隨著年齡變化人類(lèi)造血功能通?？梢跃S持穩(wěn)態(tài)，但環(huán)境因素及應(yīng)激反應(yīng)，如出血或癌癥化療副作用可能導(dǎo)致造血系統(tǒng)受損，并使造血干細(xì)胞被牽連[20-21]。因此普通腫瘤學(xué)通常建議減少老年人的化療劑量，但這可能影響治療效果。上述因素還會(huì)導(dǎo)致與骨髓發(fā)育不良和惡性腫瘤有關(guān)血液疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，說(shuō)明實(shí)際人類(lèi)造血干細(xì)胞(HSC)可能隨老化而受損，類(lèi)似于小鼠[22]。在小鼠中已經(jīng)廣泛研究了衰老HSC的影響，但是直到目前，針對(duì)人類(lèi)的研究還是較少。在小鼠中，衰老的影響是變異依賴(lài)性的，并且增殖的HSC的數(shù)量與壽命相關(guān)[23-24]。在大多數(shù)小鼠品系中，HSC數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)而下降，但在長(zhǎng)壽命的C57B1小鼠中，HSC數(shù)量，特別是邊群(SP)HSC數(shù)量增加，并且這些SP HSC在老年小鼠中具有增加的抗凋亡基因的表達(dá)。在小鼠和人類(lèi)中，除了數(shù)量的變化，HSC的分化潛能朝向髓細(xì)胞(髓偏差)和遠(yuǎn)離B淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)成也在數(shù)量和產(chǎn)生胸腺細(xì)胞的功能上顯著降低[10-11]。有研究顯示HSC衰老后，由于受損的DNA修復(fù)及端?？s短而出現(xiàn)衰老的損害，但是這對(duì)于人類(lèi)的影響是不確定的?？赡苋祟?lèi)隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)HSC衰老，進(jìn)而影響人類(lèi)身體機(jī)能和造血系統(tǒng)的衰竭[25-28]。Xiao等[28]研究證實(shí)，在各種病理?xiàng)l件下活性氧物質(zhì)( ROS )的增加損害了HSC的自我更新，并主要通過(guò)誘導(dǎo)HSC衰老而導(dǎo)致HSC過(guò)早衰竭和BM抑制，癌基因誘導(dǎo)ROS和DNA損傷的積累以及隨后的細(xì)胞衰老，這是阻止轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)形成腫瘤的重要障礙。

β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示，隨年齡增加各組人CD34+HSC/HPC逐漸出現(xiàn)明顯的衰老，老年組陽(yáng)性率明顯高于中年組及青年組。CD34+HSC/HPC混合集落形成能力研究還發(fā)現(xiàn)，健康人類(lèi)從青年到中年再到老年，CD34+HSC/HPC形成的CFU-Mix數(shù)量及細(xì)胞數(shù)逐漸減少，同年齡呈正相關(guān)。這和SA-β-半乳糖苷酶染色結(jié)果一致，說(shuō)明隨著年齡增加，CD34+造血干/祖細(xì)胞出現(xiàn)衰老，這導(dǎo)致其增殖分化能力降低，進(jìn)而可能導(dǎo)致人體出現(xiàn)造血功能的異常。本研究結(jié)果提示，人類(lèi)造血干細(xì)胞在中年時(shí)期可能就開(kāi)始出現(xiàn)衰老。人參皂苷Rg1(Rg1)是人參中最活躍的成分之一，已被證明具有抗氧化和抗衰老的特性。Rg1對(duì)小鼠暴露的慢性地塞米松(5 mg/kg，28 d)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥損傷有保護(hù)作用。我課題組發(fā)現(xiàn)：Rg1通過(guò)增強(qiáng)BMSCs的抗氧化和抗炎能力，改善造血微環(huán)境的抗衰老能力。人參皂苷Rg1的通過(guò)抑制氧化應(yīng)激抵抗HSC/HPC對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的衰老[10]。另外，人參皂苷Rg1能夠保護(hù)睪丸免受D-gal誘導(dǎo)的小鼠衰老，并且Rg1的保護(hù)作用可以通過(guò)抗氧化和p19/p53/p21等信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)[29]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果使用Rg1之類(lèi)抗衰老藥物進(jìn)行干預(yù)，是否需要在中年時(shí)期之前或者中期時(shí)期更為合適？這也是以后我們感興趣的研究方向。