曹夢(mèng)蕊，李榮旭，譚華龍，陳濟(jì)鐺，張溢珊，劉敏芳，陳建紅，張濟(jì)培

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科副黏病毒屬，3′-NP-P-M-F-HN-L-5′構(gòu)成其基因組，共編碼6種蛋白[1]。其中F蛋白和HN蛋白為NDV的囊膜蛋白，在病毒感染宿主細(xì)胞和識(shí)別受體的過程中起到重要作用，同時(shí)與NDV的抗原性和免疫原性相關(guān)[2-3]。

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起的禽呼吸道、消化道黏膜嚴(yán)重出血的一種傳染病，是養(yǎng)禽業(yè)極為重視的傳染病之一[4-5]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)家禽感染NDV的病例報(bào)道越來越多，不僅表現(xiàn)在雞群的感染情況，且水禽感染NDV的發(fā)病率、病死率逐漸升高，并以逐年增加的趨勢(shì)向全國(guó)大部分地區(qū)蔓延[6-8]。本研究旨在對(duì)分離獲得的12株NDV的F基因和HN基因進(jìn)行分子遺傳進(jìn)化分析，從而了解廣東部分地區(qū)NDV遺傳進(jìn)化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 12株NDV由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院禽病研究所分離、鑒定和保存，各毒株具體信息見表1。

1.1.2 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中的NDV全基因組序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增F基因和HN基因的引物。本試驗(yàn)2對(duì)引物分別擴(kuò)增出大小為2 653 bp和2 100 bp的2個(gè)片段，片段序列分別包含了F基因與HN基因開放閱讀框。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增 12株病毒總RNA抽提嚴(yán)格按照TransZol Up Plus RNA Kit說明書進(jìn)行，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)的使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物進(jìn)行各毒株F基因和HN基因的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

1.2.2 序列測(cè)定及同源性分析 選取PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物回收純化，與pMD18 T-Vector 16℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，于含有氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h，挑取克隆菌落在37℃振蕩培養(yǎng)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組菌送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，并與GenBank上已發(fā)表的參考毒株的F基因和HN基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并根據(jù)F基因核苷酸序列繪制遺產(chǎn)進(jìn)化樹。

表1 12株毒株的來源及分離時(shí)間

2 結(jié)果

2.1 F基因與HN基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳結(jié)果顯示，12個(gè)毒株F基因與HN基因均擴(kuò)增出約為2 653 bp和2 100 bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小一致(圖1和圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～12.分離株的F基因PCR結(jié)果；13.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000；1-12.F gene PCR results of isolates;13.Negative control

圖1 F基因的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

Fig.1 PCR product gel electrophoresis of F gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～12.分離株的HN基因PCR結(jié)果；13.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000；1-12.HN gene PCR results of isolates; 13.Negative control

圖2 HN基因的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

Fig.2 PCR product gel electrophoresis of HN gene

2.2 F基因與HN基因序列同源性分析

2.2.1 F基因序列同源性分析 根據(jù)本文12株NDV的F基因測(cè)序結(jié)果，應(yīng)用生物學(xué)軟件DNA Star-Megalign，將12個(gè)毒株與GenBank的參考毒株F基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。結(jié)果表明，5個(gè)鵝源毒株和鴨源MDK/MM-GZ/884/2016株間的核苷酸同源性均高于98%，而與GenBank中公布的基因Ⅶ型的Muscovy duck-China-Fujian-FP1-2002的核苷酸序列同源性僅在88.9%～90.4%之間。鴨源MDK/FS-SS/485/2014株和雞源CK/FS-SS/N/1997株與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E8核苷酸同源性分別為99.7%和99.5%。鴿源PG/GZ-HD/PN/2011株與鴿源PigeonChina11008、PigeonChina11208、PPMV-1pigeon-IE-806-04、strain1.3參考毒株的核苷酸序列比對(duì)同源性在90%左右。本試驗(yàn)12個(gè)毒株與疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30同源性在81.6%～91.5%之間。由F基因核苷酸序列分析可見，目前使用的疫苗株與近期流行的NDV的核苷酸同源性存在較大的差異，具體結(jié)果見圖3。

2.2.2 HN基因序列同源性分析 應(yīng)用分子生物學(xué)軟件DNA Star-Megalign，將12個(gè)毒株的HN基因測(cè)序結(jié)果與GenBank參考毒株的HN基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)室分離得到的5個(gè)鵝源毒株和鴨源MDK/MM-GZ/884/2016株間的HN基因核苷酸序列同源性高于97%，與Muscovy duck-China-Fujian-FP1-2002參考毒株間的同源性在88.7%～89.4%之間。鴨源MDK/FS-SS/485/2014株和雞源CK/FS-SS/N/1997株與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E8核苷酸序列同源性分別為99.7%和99.6%。本試驗(yàn)鴿源PG/GZ-HD/PN/2011株與基因Ⅵ型鴿源的NDV的同源性為90.2%～91.5%。12個(gè)毒株與疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的HN基因核苷酸序列同源性在80.9%～91.9%之間，詳細(xì)結(jié)果見圖4。

圖3 12株毒株與參考毒株的F基因核苷酸序列同源性比較

圖4 12株毒株與參考毒株的HN基因核苷酸序列同源性比較

2.3 F基因和HN基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析

2.3.1 F基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析 根據(jù)測(cè)定的F基因序列推導(dǎo)的F蛋白共編碼553個(gè)氨基酸殘基，12個(gè)毒株的F基因裂解區(qū)域第112-117位氨基酸殘基均為112RRQKRF117，符合NDV強(qiáng)毒株裂解區(qū)域的氨基酸序列特征。F基因7個(gè)中和位點(diǎn)分別位于第72、74、75、78、79、157-171和343位氨基酸殘基，其中9株毒株的第170位均出現(xiàn)D→N的變異。

2.3.2 HN基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析 12個(gè)毒株HN基因共編碼571個(gè)氨基酸殘基，均含有13個(gè)完全保守的半胱氨酸殘基，與目前報(bào)道的NDV的半胱氨酸殘基位點(diǎn)一致。10個(gè)分離株的HN蛋白第514位氨基酸殘基出現(xiàn)Ⅰ→Ⅴ的變異；2011年后分離的7個(gè)毒株中的6個(gè)在第347位氨基酸殘基出現(xiàn)E→D的變異。各區(qū)域相關(guān)氨基酸殘基序列與參考株相比均有不同程度的變異，各區(qū)域位點(diǎn)的氨基酸殘基變異情況比較見表2。

2.4 F基因的遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)從GenBank下載的43個(gè)參考毒株(包括Class Ⅰ 6個(gè)毒株和Class Ⅱ 9個(gè)基因型的37個(gè)毒株)和本實(shí)驗(yàn)室分離的12個(gè)毒株的F基因的編碼區(qū)第47-420位核苷酸序列，應(yīng)用分子生物學(xué)軟件DNA Star和MEGA 5.0繪制遺傳進(jìn)化樹(圖5)。12個(gè)分離株均屬ClassⅡ，其中9個(gè)毒株屬于基因Ⅶ型，包括5株鵝源毒株、3株鴨源和雞源CK/YF-LD/L/1997株。鴨源MDK/FS-SS/485/2014株和雞源CK/FS-SS/N/1997株屬于基因Ⅸ型。鴿源PG/GZ-HD/PN/2011株屬于基因Ⅵ型，與目前鴿源NDV的流行基因型一致。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，廣東地區(qū)流行的NDV以基因Ⅶ型為主，這與Liu H等[9]的研究結(jié)果相一致。該基因型的毒株對(duì)易感禽種類和地域沒有明顯的選擇性，同種基因型毒株之間F基因和HN基因變異隨機(jī)性較大，水禽感染基因Ⅶ病毒的機(jī)率明顯增加，而同時(shí)在禽群中又伴隨有Ⅸ型等其他基因型散發(fā)[10-13]。12個(gè)分離株的F基因和HN基因序列同源性分析顯示，12個(gè)分離株之間的同源性差異較大，2個(gè)雞源毒株的F基因和HN基因間的同源性低于87%，4個(gè)鴨源毒株間F基因和HN基因間的同源性在83.5%～99.8%之間，但5個(gè)鵝源間的F基因和HN基因間的同源性高于97.4%；在不同種易感禽類之間，1個(gè)雞源毒株、3個(gè)鴨源毒株和5個(gè)鵝源毒株均屬基因Ⅶ型，其中雞源毒株與3個(gè)鴨源毒株的同源性在90%～96.3%之間，雞源毒株與5個(gè)鵝源毒株的同源性在90%～90.9%之間，3個(gè)鴨源毒株與5個(gè)鵝源毒株的同源性在89.7%～99%之間?？梢姺蛛x株的F基因和HN存在遺傳變異多樣性，可能與廣東的養(yǎng)殖區(qū)域和養(yǎng)殖模式有關(guān)。

12個(gè)毒株的F蛋白裂解區(qū)域氨基酸序列均為112RRQKRF117，HN基因共編碼571個(gè)氨基酸殘基，符合NDV強(qiáng)毒株的特征[14-15]。12個(gè)分離株的F基因和HN基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)毒株在F基因編碼的氨基酸的第170位氨基酸殘基出現(xiàn)D→N的變異,10個(gè)毒株的HN基因編碼的氨基酸第514氨基酸殘基出現(xiàn)I→V的變異，據(jù)研究報(bào)道，HN 蛋白中和表位的氨基酸突變會(huì)影響抗原表位的形成，導(dǎo)致病毒粒子更容易逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)[16]。

本研究12個(gè)分離株中，9個(gè)屬于基因Ⅶ型，2個(gè)屬于基因Ⅸ型，1個(gè)屬于基因Ⅵ型，然而目前我國(guó)用于防控新城疫的疫苗株La Sota、Clone30、B1屬于基因Ⅱ型，Mukteswar 屬于基因 Ш型。由此可見，疫苗株與分離株之間存在一定的抗原差異性，這種差異性可能導(dǎo)致疫苗免疫保護(hù)率不高而發(fā)生疫病的流行，因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)新城疫野毒株分子遺傳的演變的監(jiān)控，為更好地篩選出疫苗候選株奠定基礎(chǔ)。

●.本試驗(yàn)毒株●.The strain tested