楚品品，蔣智勇，林德銳，徐志宏，李 艷，勾紅潮，卞志標(biāo)，李春玲*，蔡汝健*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣東廣州，510640; 2. 廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 511356)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種高度傳染性腸道疾病，臨床癥狀以嘔吐、水樣腹瀉及脫水等為主。各年齡豬均可感染，對1周齡～2周齡尤其10 d內(nèi)的仔豬影響最大，發(fā)病率與病死率可高達(dá)100%。2010年前，我國PED的發(fā)生一直處于散發(fā)狀態(tài)，直到2010年秋，在我國南部出現(xiàn)暴發(fā)，尤其是變異株的不斷出現(xiàn)，盡管使用疫苗，卻依然對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了持續(xù)而重大的影響[1]。

PEDV基因組為不分段的單股正鏈RNA，基因組全長約28 kb，除5′端非編碼區(qū)與3′端非編碼區(qū)外，至少還有7個開放閱讀框，編碼4個主要結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜(M)蛋白與核衣殼(N)蛋白，3個非結(jié)構(gòu)蛋白，即復(fù)制酶1 a和1 b及ORF3輔助蛋白。其中，由于S基因存在高頻變異，對S基因的監(jiān)控在一定程度上反映了毒株的變異性[2]。另外，已有研究表明PEDV弱毒疫苗株與親代野毒株相比，ORF3存在不同程度的大片段連續(xù)缺失，該缺失可能與PEDV的毒力有關(guān)，也為疫苗株與野毒株的區(qū)分提供了一定依據(jù)[3]。

病毒的分離與培養(yǎng)為其進(jìn)一步研究提供了必要的基礎(chǔ)，1988年，Hoffmann M等[4]建立了以Vero細(xì)胞為基礎(chǔ)的PEDV分離方法，并得到了廣泛的應(yīng)用。由于病毒對細(xì)胞的適應(yīng)性往往與細(xì)胞的特性、病毒的特性及培養(yǎng)條件相關(guān)，本研究參考Hoffmann等所建立方法，分離到1株對Vero敏感的PEDV變異株，同時擴(kuò)增及測序獲得了其S基因和ORF3基因序列，分析了S蛋白的主要抗原表位，同時做了序列一致性及進(jìn)化樹分析，以期為后續(xù)PEDV分子生物學(xué)分析、流行病學(xué)調(diào)查及篩選更為有效的疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與細(xì)胞 病料為廣東省某養(yǎng)豬場送檢腹瀉死亡仔豬小腸和內(nèi)容物，保存于-70℃。Vero細(xì)胞為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所豬病研究室保存。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、胰酶及DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；病毒DNA/RNA提取試劑盒，Magen公司產(chǎn)品；RT-PCR相關(guān)試劑盒，Vazyme公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品；膠體金檢測試劑盒，Bionote公司產(chǎn)品；引物合成及序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；其他所用試劑均為進(jìn)口或者國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 將病料樣品剪碎后，與PBS緩沖液以1∶5(W/V)比例進(jìn)行研磨處理，反復(fù)凍融3次后，4℃、10 000 r/min離心3 min，收集上清，使用0.22 μm微孔濾器過濾，濾液分裝，置-70℃保存。

1.2.2 膠體金試劑盒檢測 采用豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)及豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)膠體金試劑盒對病料進(jìn)行初步檢測，結(jié)果判定如說明書所述，在視窗左邊出現(xiàn)2條帶結(jié)果為陽性，僅出現(xiàn)對照帶為陰性，未出現(xiàn)對照帶結(jié)果無效。

1.2.3 腹瀉病原RT-PCR檢測 對于豬腹瀉病毒的檢測已建立了多種多重RT-PCR方法，參照文獻(xiàn)[5]所建立多重RT-PCR方法(PEDV上游引物：5′-TTCTGAGTCACGAACAG-CCA-3′，PEDV下游引物：5′-CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3′，目的片段大小為651 bp；TGEV上游引物：5′-TTCAAGGT-CACGCTCTCA-3′，TGEV下游引物：5′-GCTT-CCAAACAAAATGCTA-3′，目的片段大小為397 bp；PoRV上游引物：5′-TCTTTCGT-TCTTGTGAGT-3′，PoRV下游引物：5′-TTGAGATAATGTGTCCTTC-3′，目的片段大小為270 bp) 對病料進(jìn)一步檢測。

1.2.4 病毒分離 PEDV的分離參考Hoffmann M等[4]建立的方法，稍做修改，具體如下：按常規(guī)方法培養(yǎng)Vero細(xì)胞，傳入6孔板，待其長至單層且狀態(tài)良好，棄去培養(yǎng)液，PBS洗板2次，將上述處理好的病毒液用細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM稀釋5倍，500 μL/孔傳入6孔板，輕輕晃動，使病毒液均勻覆蓋細(xì)胞表面，將6孔板置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h，期間晃動數(shù)次，1 h后取出培養(yǎng)板，棄去病毒液，PBS洗板1次，加入含10 μg/mL胰酶的DMEM培養(yǎng)液2 mL，再次置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察，待其出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)或者培養(yǎng)至7 d，收毒，記為第1代，置于-70℃保存或者反復(fù)凍融3次，在Vero細(xì)胞中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2.5 S基因和ORF3基因序列克隆及測序 根據(jù)GenBank收錄的PEDV CV777全基因組序列設(shè)計特異引物(引物序列見表1)，擴(kuò)增分離毒株的S基因和ORF3基因全序列，電泳結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行純化并克隆測序。

表1 PEDV S基因和ORF3基因特異引物序列

1.2.6 序列分析 利用DNA Star軟件對測得S基因相關(guān)序列進(jìn)行拼接，獲得S基因全序列。登錄NCBI GenBank下載國內(nèi)外PEDV分離株和疫苗株的S基因和ORF3基因序列做參考(PEDV參考毒株信息見表2)，利用DNA Star及Biodit軟件進(jìn)行序列比對分析，同時利用MEGA6.0軟件選擇NJ方法(Bootstrap 1 000)對核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉病原檢測

采用豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒及豬傳染性胃腸炎病毒膠體金試劑盒對病料進(jìn)行初步檢測，僅PEDV膠體金呈現(xiàn)陽性結(jié)果，其他2種腹瀉相關(guān)病毒為陰性結(jié)果。參考已建立的多重RT-PCR方法對病料進(jìn)一步檢測，經(jīng)電泳分析，結(jié)果如圖1，與膠體金結(jié)果一致，僅出現(xiàn)了PEDV相應(yīng)條帶，而另外2種腹瀉相關(guān)病毒無條帶產(chǎn)生，為陰性。

2.2 病毒的分離與培養(yǎng)

將研磨凍融過濾除菌后的病料接于Vero細(xì)胞上，第1代培養(yǎng)至第7天時出現(xiàn)細(xì)胞病變特征，傳至第4代時在1天內(nèi)細(xì)胞病變特征明顯，細(xì)胞腫脹、變圓、融合、合胞體形成，最終脫落等，連續(xù)傳至第12代，細(xì)胞病變特性及病變時間穩(wěn)定。細(xì)胞病變情況如圖2，將分離到的病毒命名為GDqy2017。

表2 PEDV參考毒株信息

注：S和O分別代表S基因和ORF3基因序列登錄號，未標(biāo)注的為全基因序列登錄號。

Note：S and O represent the GenBank accession numbers of the S and ORF3 gene sequences，and others represent the GenBank accession numbers of the full genome sequences.

2.3 分離株特異性RT-PCR鑒定

對病變產(chǎn)物用3種腹瀉病原特異引物進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示，僅PEDV引物擴(kuò)增獲得了預(yù)期大小條帶，而其他病原結(jié)果為陰性(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對照；2.豬流行性腹瀉病毒；3.豬傳染性胃腸炎病毒；4.豬輪狀病毒

M.DNA Marker DL 2000；1. Negative control；2.PEDV；3.TGEV;4.PoRV

圖1 PEDV、PoRV和TGEV的RT-PCR檢測結(jié)果

Fig.1 RT-PCR detection results of PEDV,PoRV and TGEV

2.4 S基因及ORF3基因序列擴(kuò)增

使用前期設(shè)計的3對S基因特異引物，分段擴(kuò)增分離株的S基因全序列，結(jié)果見圖4A，分別獲得了大小為1 654、1 610、1 447 bp的條帶，與預(yù)期大小相符。利用ORF3基因的特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同樣獲得了預(yù)期大小的目的條帶(848 bp)，結(jié)果見圖4B。

2.5 分離株S基因序列分析

利用DNA Star軟件對測得的3段S基因相關(guān)序列進(jìn)行拼接與組裝，獲得了GDqy 2017 S基因的全序列，由4 158個核苷酸組成，編碼1 385個氨基酸。與經(jīng)典毒株CV777相比，S基因存在較大變異，其氨基酸序列中出現(xiàn)98處突變，2處插入(58QGVN61和140N)，2處缺失(158DI159和1194Y)(圖5)，不存在中國疫苗株CV777 vaccine中157位的缺失，另外與CH/GDQY/2011、GDQY/2011插入缺失情況不同，與CHGD01、GD1及HBHG4的插入缺失相同，但是存在不同的位點(diǎn)突變。

以國內(nèi)外具有代表性及國內(nèi)近幾年分離的PEDV毒株為參考株，與本次分離株GDqy2017進(jìn)行S基因核苷酸序列和氨基酸序列比對分析，序列同源性分別為93.7%～99.1%和92.4%～98.8%，與國內(nèi)2010年后出現(xiàn)的參考株(除CH-XBC-01-2015、CH/GDQY/2011)序列同源性較高，分別為95.8%～99.1%和94.8%～98.8%，與2010年以前出現(xiàn)的參考株(包括CH-XBC-01-2015、CH/GDQY/2011)同源性偏低，僅93.7%～95.2%和92.5%～94.6%，與2016年湖北分離株HBHG4的同源性最高，分別為99.1%和98.8%；與國外大部分參考株序列同源性偏低，分別為93.9%～95.2%和92.4%～95.2%，與SBPED0211-1(泰國)、PEI-023(加拿大)和USA/Colorado/2013 (美國)序列同源性較高，分別為96.1%、97.5%、97.6%和96.2%、97.5%、97.7%，與CV777及疫苗株CV777 vaccine的序列同源性分別為94.1%(核苷酸序列)、92.7%(氨基酸序列)和94.2%(核苷酸序列)、93.4%(氨基酸序列)。

A.正常Vero細(xì)胞；B.樣品處理后接種Vero細(xì)胞-F1；C.感染 Vero細(xì)胞-F4A.Normal Vero cells; B.Infected Vero cells-F1; C.Infected Vero cells-F4

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對照；2.豬傳染性胃腸炎病毒；3.豬流行性腹瀉病毒；4.豬輪狀病毒

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2.TGEV；3.PEDV；4.PoRV

圖3 PEDV、PoRV和TGEV RT-PCR鑒定結(jié)果

Fig.3 RT-PCR identification results of PEDV,PoRV and TGEV

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；4、5.陰性對照；1.S1-P1/P2擴(kuò)增產(chǎn)物；2.S2-P1/P2擴(kuò)增產(chǎn)物；3.S3-P1/P2擴(kuò)增產(chǎn)物；6.ORF3-P1/P2擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；4，5.Negative control；1.Amplification product of S1-P1/P2；2.Amplification product of S2-P1/P2；3.Amplification product of S3-P1/P2；6.Amplification product of ORF3-P1/P2

圖4 S基因和ORF3基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.4 RT-PCR amplification resultes of S gene and ORF3 gene

方框內(nèi)為插入或缺失位點(diǎn)，黑色三角標(biāo)注為本次分離株GDqy2017Insertions and deletions are marked by boxes; GDqy2017 is marked by black triangle

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析由圖6結(jié)果顯示，PEDV毒株可分為3個群，GDqy2017與14株2010年后國內(nèi)分離毒株、泰國分離株(SBPED0211-1)、加拿大分離株(PEI-023)、美國分離株(USA/Colorado/2013)及韓國株(Chinju99)、日本株(NK)同屬群1，3株中國分離株株(CH/S、 LZC和CH/GDQY/2011)、比利時株CV777、英國株Br1/87和疫苗株(CV777 Vaccine、attenuated DR13)共同構(gòu)成群2，3株2010年前國內(nèi)分離株(JS-2004-2、LJB/03、DX)與2015年國內(nèi)分離株CH-XBC-01-2015，以及越南分離株HUA-PED58、美國分離株OH851、德國分離株GER/L00721/2014構(gòu)成群3。

PEDV S蛋白作為膜表面糖蛋白，包含4個重要的中和抗原表位，對本次分離株以及其他3株廣東分離株與經(jīng)典毒株CV777的4個關(guān)鍵抗原表位分析可知(圖7)，所有參與比對毒株，抗原表位748YSNIGVCK755與1368GPRLQPY1374較為保守，不存在突變，在所有廣東株中抗原表位764SQSGQVKI771保持一致，而不同于CV777764SQYGQVKI771，在最長的抗原表位中，GDqy2017株存在1處不同于其他對比株的獨(dú)特突變，即640處F→S。

2.6 分離株ORF3基因序列分析

比對分析發(fā)現(xiàn)GDqy2017 ORF3基因完整序列其由675個核苷酸組成，編碼224個氨基酸。將GDqy2017、CV777、 我國疫苗株CV777及韓國疫苗株attenuated DR13的ORF3氨基酸序列進(jìn)行比對(圖8)發(fā)現(xiàn)中國疫苗株CV777 vaccine和韓國疫苗株attenuated DR13僅編碼91個氨基酸，GDqy2017與經(jīng)典株CV777一樣，編碼224個氨基酸，不存在疫苗株中特有的大片段缺失及截短現(xiàn)象，但與經(jīng)典株CV777相比，存在10處突變，與中國疫苗株CV777 vaccine相比，僅存在1處突變(25位L→S)。

GDqy2017 ORF3基因核苷酸序列和氨基酸序列與參考株比對分析結(jié)果顯示， GDqy2017 ORF3與國內(nèi)外參考株序列同源性分別為93.4%～99.0%和91.2%～100%。其中與中國疫苗株CV777 vaccine的同源性為95.3%(nt)和91.2%(aa)，與CH/GDQY/2011核苷酸序列同源性最高(99.0%)，與AJ1102、CH/GDQY/2011和CHGD-01氨基酸序列完全一致，達(dá)到100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示(圖9)，PEDV毒株分4個群，13株2010年后國內(nèi)分離株、1株2010年前國內(nèi)分離株(CH/S)及2株美國分離株(USA/Colorado/2013、OH851)和1株韓國分離株(Chinju99)組成群1，2株疫苗株(CV777 Vaccine、attenuated DR13)構(gòu)成群2,CV777、Br1/87和LZC構(gòu)成群3，GDqy2017、廣東其他分離株及2007年分離株DX構(gòu)成群4。

黑色三角標(biāo)記為本次分離株GDqy2017

GDqy2017 is marked by black triangle

圖6 PEDV S基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析

Fig.6 Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequences of PEDV S gene

方框內(nèi)為主要抗原表位，黑色三角標(biāo)記為本次分離株GDqy2017The major epitopes are marked by boxes,GDqy2017 is marked by black triangle

方框內(nèi)為突變位點(diǎn)，黑色三角標(biāo)記為本次分離株GDqy2017Insertions and deletions are marked by boxes; GDqy2017 is marked by black triangle

黑色三角標(biāo)記為本次分離株GDqy2017GDqy2017 is marked by black triangle

3 討論

豬流行性腹瀉自出現(xiàn)以來，已廣泛流行于歐洲和亞洲的多個國家和地區(qū)，我國于1984年分離到了第1株P(guān)EDV，之后各地零星發(fā)生PEDV的感染，至2010年秋出現(xiàn)大范圍暴發(fā)，2013年，美國也出現(xiàn)了PEDV的相關(guān)報道[6]。盡管有疫苗的使用，但卻依然無法阻止新毒株的流行。PEDV更廣泛的傳播以及變異株的不斷出現(xiàn)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了更大的壓力，也對PEDV更為有效疫苗的研發(fā)提出了更為迫切的需求。

本研究在Hoffmann M建立的方法基礎(chǔ)上，稍加修改，利用本研究室保存的Vero細(xì)胞分離到了1株P(guān)EDV變異株，命名為GDqy2017。由于病毒對細(xì)胞的適應(yīng)性往往與細(xì)胞的特性、病毒的特性及培養(yǎng)條件相關(guān)，部分報道分離到的PEDV前幾代并不在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生細(xì)胞病變，僅通過分子生物學(xué)檢測手段可檢測到PEDV的存在，盲傳多代后才可觀察到細(xì)胞病變[7-11]。而該分離株對本研究所使用Vero細(xì)胞敏感，接種第1代在第7天便出現(xiàn)細(xì)胞病變，傳至第4代在1天內(nèi)便出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變特征，連續(xù)傳至第12代，細(xì)胞病變時間與形態(tài)穩(wěn)定。

為進(jìn)一步了解該病毒，對其關(guān)鍵基因S基因與ORF3基因進(jìn)行擴(kuò)增與分析。本研究所獲得分離株GDqy2017全長4 158 nt，編碼1 385個氨基酸。PEDV作為冠狀病毒Ⅰ群成員，S蛋白同樣可分為2個功能區(qū)，即負(fù)責(zé)與受體結(jié)合的S1和膜融合的S2，研究表明S蛋白的變異集中在S1區(qū)，尤其集中在其氨基端[12]。與經(jīng)典毒株CV777 S蛋白相比，本次分離株氨基酸序列中出現(xiàn)98處突變、2處插入及2處缺失，大部分突變及全部插入和1處缺失存在于S1區(qū)的氨基端，有1處缺失出現(xiàn)在了較為穩(wěn)定的S2區(qū)。PEDV S蛋白作為膜表面糖蛋白，包含4個重要的中和抗原表位[13]，插入與缺失并未發(fā)生在GDqy2017的4處抗原表位中，但是存在部分突變，這些突變在廣東分離株中大部分一致，有1處僅發(fā)生在GDqy2017中，即640處的F(苯丙氨酸)突變?yōu)镾(絲氨酸)，苯丙氨酸屬疏水氨基酸，而絲氨酸為親水氨基酸。這些變化對病毒的致病性、抗原性乃至體外培養(yǎng)對細(xì)胞的適應(yīng)性有怎樣的影響有待研究。

從S基因序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，GDqy2017與國內(nèi)2010年后出現(xiàn)的參考株(除CH-XBC-01-2015、CH/GDQY/2011)序列同源性較高，分別為95.8%～99.1%和94.8%～98.8%，且同屬于一個進(jìn)化群，其中與GDQY/2011處于同一進(jìn)化群的不同分支，與CHGD01親緣關(guān)系近。與CH/GDQY/2011的差異較大，序列同源性僅為94.7%(核苷酸序列)和93.6%(氨基酸序列)，屬于不同的進(jìn)化群。與經(jīng)典毒株CV777、國內(nèi)早期經(jīng)典株及中國疫苗株CV777 vaccine、韓國疫苗株attenuated DR13序列差異較大，同源性較低且進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，提示當(dāng)前流行毒株仍以變異株為主，對以CV777為原型改造的疫苗株的有效性提出了挑戰(zhàn)。

ORF3基因位于S基因與E基因之間，編碼一輔助蛋白，研究表明其與病毒致病性密切相關(guān)，疫苗株CV777與疫苗株attenuated DR13基因中存在大片段連續(xù)缺失，該缺失導(dǎo)致了基因表達(dá)的截短(僅編碼91個氨基酸)，使得PEDV毒性變?nèi)?，也為臨床診斷提供了一定依據(jù)[14]。本研究分離株GDqy2017基因675 nt，編碼224個氨基酸，與經(jīng)典毒株CV777相同，不存在疫苗株中的大片段缺失及表達(dá)截短現(xiàn)像。與經(jīng)典毒株CV777相比，存在10處突變，與中國疫苗株CV777相比，僅存在一處突變。進(jìn)化樹分析顯示，GDqy2017(G4)與經(jīng)典毒株CV777(G3)以及疫苗株(G2)分別屬于不同的群，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與各群的核苷酸序列同源性分為93.4%～96.1%(G1)、95.3%(G2)、94.8%～96.1%(G3)和97.8%～99.0%(G4)，與廣東其他分離株處于同一分支，具有一定地域性，其中與2012年廣東分離株CHGD01核苷酸序列同源性為98.8%，具有完全同源性的氨基酸序列。

綜上所述，本研究分離到一株豬流行性腹瀉病毒變異株(GDqy2017)，對其關(guān)鍵基因S基因與ORF3基因分析顯示，其與國內(nèi)近幾年分離株相關(guān)性較大(尤其2012年廣東分離株CHGD01)，但與CHGD01相比，它對Vero細(xì)胞更敏感，有更強(qiáng)的適應(yīng)性，為篩選與研制更為有效的疫苗提供了備選與依據(jù)。