陳伯祥，楊 明，成偉偉，李 杰，豆林濤

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000)

山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)屬于痘病毒科脊椎動物亞科羊痘病毒屬，能夠感染山羊而引起山羊痘[1-2]。山羊痘是以全身皮膚和黏膜部位出現(xiàn)典型痘疹的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[3]，該病具有較高的發(fā)病率與病死率，分布范圍廣、流行率高，給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物傳染病[1,4]，我國也將其列為一類動物疫病[5-6]。

GTPV為大型有囊膜的雙股DNA病毒，成熟的病毒粒子呈卵圓形或磚型，大小約310 nm×204 nm，表面有復(fù)合對稱結(jié)構(gòu)。GTPV的基因組為一個共價閉合的雙鏈DNA，大小約為149 kb，G+C含量約為25%[7]。GTPV的基因組包含1個相對保守的中央編碼區(qū)域和2個結(jié)構(gòu)相同的末端反向重復(fù)序列(inverted terminal repeat，ITR),中央編碼區(qū)(ORF24-ORF123)基因主要與病毒DNA復(fù)制、病毒粒子的構(gòu)建和裝配等有關(guān)，在基因數(shù)目和排序上高度保守，位于兩側(cè)末端反向重復(fù)序列(ORF1-ORF23、ORF124-ORF156)，主要與病毒感染宿主范圍和毒力等特性相關(guān)[8]。近年來，p32蛋白的研究比較廣泛，P32基因位于GTPV的中央編碼區(qū)，p32蛋白是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白，可是p32蛋白全長表達(dá)比較困難，截斷表達(dá)免疫原性較差，所以p32蛋白作為山羊痘病毒診斷試劑盒的包被抗原有所限制，而ORF112基因也位于GTPV的中央編碼區(qū)，中央編碼區(qū)的基因主要與病毒結(jié)構(gòu)蛋白等相關(guān)，又由于GTPV ORF112蛋白與痘苗病毒A27L蛋白具有很高的同源性[7]，再加之ORF112基因全長較短,易于表達(dá)，所以O(shè)RF112蛋白在山羊痘病毒診斷與疫苗研究方面具有很大的潛力，成為新的研究熱點之一。本研究進(jìn)行了GTPV ORF112基因擴增，構(gòu)建ORF112基因的原核表達(dá)載體pET-ORF112，將其轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(E.coli)BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，Western blot檢測了ORF112蛋白的表達(dá)情況與抗原性，并用ELISA方法對該蛋白的免疫原性進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Balb/c小鼠，雌性，4周～6周齡，體重16 g～18 g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.1.2 毒株、菌株和質(zhì)粒 山羊痘病毒株(GTPV-S-1)和山羊痘病毒全病毒血清均由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所動物醫(yī)學(xué)研究室保存；大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pET-28a(+)，Addgene公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；2×PfuPCR Master Mix 、DNA Marker 、蛋白Marker、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；His-Bind Column(Ni-NTA)樹脂，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Thermo Fisher科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 GTPV ORF112基因的擴增 參照GenBank中公布的GTPV ORF112基因序列并結(jié)合表達(dá)載體pET-28a(+)的酶切位點序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計擴增GTPV ORF112基因的引物，上游引物：5′-CCGGATCCCCATGGACAGAGCGTTATCCATC-3′(下劃線處為BamHⅠ酶切位點)，下游引物：5′-CGAAGCTTAAGTGTTGTACTTCTTCC-3′(下劃線處為Hind Ⅲ酶切位點)，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。提取GTPV的DNA，配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

1.2.2 GTPV ORF112基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將純化回收的ORF112基因擴增產(chǎn)物和pET-28a(+)分別進(jìn)行Hind Ⅲ+BamHⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶4℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)，挑取單個菌落搖菌培養(yǎng)14 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定正確后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，測序正確后進(jìn)行保存?zhèn)溆?，并將正確的重組質(zhì)粒命名為pET-ORF112。

1.2.3 重組蛋白ORF112的表達(dá)純化 將構(gòu)建的pET-112重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21(DE3)中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm值為0.4～0.9時，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時設(shè)pET-112重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的未誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行對照，于4℃離心收集菌體置于冰浴中超聲裂解。然后10 000 r/min離心10 min，分別收集上清與沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定后用北京全式金生物技術(shù)有限公司的鎳柱His-Bind Column(Ni-NTA)純化系統(tǒng)純化GTPV的ORF112重組蛋白。

1.2.4 重組蛋白ORF112的Western blot鑒定 取純化的ORF112重組蛋白稀釋液進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳分析后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，置入50 g/L的脫脂奶粉液中4℃過夜封閉，PBST洗膜3次，每次10 min，加入GTPV全病毒血清置于37℃孵育2 h后，PBST洗膜3次，將HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG用PBST以1∶4 000稀釋后加入，置37℃孵育2 h后，PBST洗膜3次，最后用15 mg DAB粉末和9 mg CoCl2(H2O)6溶于30 mL PBS混勻，再加入10 μL過氧化氫配置的顯色液進(jìn)行顯色后，用PBS終止反應(yīng)并觀察結(jié)果。

1.2.5 重組蛋白ORF112的免疫原性分析 將40只4周齡～6周齡雌性Balb/c小鼠隨機分為4組，A組：重組蛋白ORF112免疫組；B組：山羊痘活疫苗免疫組；C組：GST標(biāo)簽蛋白免疫組；D組：PBS對照組。按照各組對應(yīng)抗原共免疫接種3次，初免按照100 μg/只小鼠劑量將各組對應(yīng)抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，經(jīng)腹股溝和腳掌板皮下免疫小鼠，初次免疫后第14天將各組對應(yīng)抗原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化后等劑量加強免疫1次，初次免疫后第21天將各組對應(yīng)抗原等劑量再加強免疫1次。在第3次免疫后0、7、14、21、28 d采集小鼠尾靜脈血，分離血清，采用間接ELISA方法檢測各組血清抗體水平。

2 結(jié)果

2.1 GTPV ORF112基因的擴增

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物大小約為461 bp，與預(yù)期的ORF112基因的大小一致(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.擴增的ORF112基因M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR-amplified ORF112 gene

2.2 GTPV ORF112基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pET-112進(jìn)行Hind Ⅲ+BamHⅠ雙酶切，電泳鑒定顯示約5 369 bp和461 bp的載體和目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)，測序結(jié)果表明表達(dá)載體pET-ORF112構(gòu)建成功。

1.ORF112擴增產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒pET-ORF112的Hind Ⅲ+BamHⅠ酶切產(chǎn)物；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

1.Products of PCR-amplified ORF112 gene；2.Products of pET-ORF112 digested withHind Ⅲ andBamHⅠ；M.DNA Marker DL 2 000

圖2重組pET-ORF112質(zhì)粒酶切鑒定

Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET-ORF112

2.3 重組蛋白的表達(dá)純化

SDS-PAGE分析顯示，誘導(dǎo)后的重組菌pET-112/BL21(DE3)在約23 ku處可見一條特異的蛋白條帶，大小與預(yù)期一致，且主要以可溶性的形式存在，對其進(jìn)行了純化獲得了純度較好的目的蛋白(圖3)。

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定

Western blot結(jié)果顯示，制備的重組蛋白可與GTPV全病毒血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在約23 ku處可見印跡條帶，而陰性對照未見該條帶(圖4)。表明ORF112蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中獲得了表達(dá)且具有較好的抗原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET-ORF112陽性BL21菌體蛋白；2.誘導(dǎo)后的重組質(zhì)粒pET-ORF112陽性BL21菌體蛋白；3.純化后的重組蛋白ORF112

M.Protein molecular weight Marker; 1.pET-ORF112 without induction; 2.The expression products of pET-ORF112 with IPTG induction; 3.Purified recombinant ORF112

圖3 SDS-PAGE分析重組蛋白ORF112表達(dá)與純化

Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression and purification of fusion protein ORF112

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化的重組蛋白ORF112；2.陰性對照

M.Protein molecular weight Marker; 1.Purified ORF112 recombinant protein; 2.Negative control

圖4 Western blot鑒定重組蛋白ORF112

Fig.4 Western blot identification of recombinant protein ORF112

2.5 重組蛋白ORF112免疫小鼠血清抗體水平ELISA檢測結(jié)果

各試驗組小鼠血清抗體效價ELISA檢測結(jié)果見表1。從表1可知，免疫后7 d，注射重組蛋白ORF112免疫組和山羊痘疫苗組的抗體水平開始升高，且顯著高于GST標(biāo)簽蛋白免疫組和PBS對照組的，14 d時抗體水平達(dá)到最高。山羊痘活疫苗組的抗體水平也顯著高于重組ORF112蛋白組。而GST標(biāo)簽蛋白免疫組和PBS組的抗體水平?jīng)]有明顯變化。結(jié)果說明，表達(dá)的ORF112蛋白具有較好的免疫原性。

表1 血清抗體水平ELISA檢測檢測

3 討論

山羊痘病毒可引起山羊和綿羊的羊痘，該病主要經(jīng)呼吸道、消化道及損傷的皮膚傳染，常呈暴發(fā)性或地方性流行，在我國西北、東北及華北地區(qū)均有流行，特別是內(nèi)蒙、甘肅、青海等地區(qū)常呈暴發(fā)性流行[9-10]，各年齡段的羊?qū)Ρ静【赘校g羊易感性最高，病死率可達(dá)50%以上，還可導(dǎo)致母羊流產(chǎn)[11]，給養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成巨大威脅以及嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

山羊痘病毒基因組有147個開放閱讀框(opening read frame,ORF)，編碼產(chǎn)物在53個～2 027個之間，中心編碼區(qū)主要編碼各種轉(zhuǎn)錄酶和修飾酶及結(jié)構(gòu)蛋白等，兩邊的末端反向重復(fù)序列主要編碼與免疫調(diào)節(jié)和逃避相關(guān)的蛋白，如趨化因子結(jié)合蛋白、IL-10、EGF蛋白、PKR抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑等[7-12]。國內(nèi)外對于山羊痘病毒蛋白的研究多集中在囊膜蛋白p32上，因為該蛋白是世界各地所有分離鑒定的山羊痘病毒所共有且特有的蛋白，又是山羊痘病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，能夠刺激免疫機體產(chǎn)生中和抗體。p32蛋白全段表達(dá)比較困難，而截短后的P32基因片段的表達(dá)雖然容易了，但表達(dá)蛋白的抗原性和免疫原性卻較差，所以針對山羊痘病毒的檢測與亞單位疫苗研究必須探索新的蛋白。研究表明，GTPV ORF112蛋白與痘苗病毒A27L蛋白具有很高的同源性[13]，痘苗病毒A27L蛋白在病毒與細(xì)胞的黏附過程中發(fā)揮重要作用，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的中和抗體[14-16]，所以對于GTPV ORF112蛋白非常有必要進(jìn)行更進(jìn)一步研究。本研究擴增了GTPV ORF112基因并將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)，進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行了表達(dá)條件的優(yōu)化，探索出在IPTG濃度為1.0 mmol/L時低溫低轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)表達(dá)效果較好，GTPV ORF112蛋白沒有信號肽和跨膜域等特殊結(jié)構(gòu)，易于實現(xiàn)其全長基因的原核表達(dá)，較p32蛋白容易表達(dá)。本研究獲得了ORF112蛋白較高水平的可溶性表達(dá)，對ORF112蛋白多抗血清的制備與其功能的研究具有重要作用。

本試驗對ORF112蛋白進(jìn)行了純化，用GTPV全病毒血清作為一抗進(jìn)行了Western blot反應(yīng)，結(jié)果表明ORF112蛋白具有較好的抗原性；用鑒定純化的ORF112蛋白免疫接種小鼠，采用ELISA方法對小鼠血清抗體水平檢測發(fā)現(xiàn)，ORF112蛋白免疫組抗體水平與PBS對照組的差異顯著，表明ORF112蛋白具有良好的免疫原性。ORF112蛋白相較于p32蛋白易于表達(dá)，又與GTPV全病毒血清在免疫反應(yīng)方面表現(xiàn)出較強的特異性，加之ORF112蛋白具有良好的免疫原性， 所以為山羊痘病毒病的診斷與疫苗研究方面創(chuàng)造了條件，為山羊痘病毒致病機理研究奠定了基礎(chǔ)。