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自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種常見(jiàn)的急性腦血管事件。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其在西方國(guó)家的發(fā)生率約為9/10萬(wàn)。盡管只占全部中風(fēng)事件的5%，但蛛網(wǎng)膜下腔出血的預(yù)后很差，死亡率和致殘率均較高[1]。

早期腦損傷通常于蛛網(wǎng)膜下腔出血后72 h內(nèi)發(fā)生，其機(jī)制包括顱內(nèi)壓升高，氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎癥，血腦屏障破壞和腦缺血。這些因素共同導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和腦水腫，加重顱內(nèi)壓以及早期腦損傷[2]。

他汀類藥物是羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，除作為降膽固醇藥物，還具有對(duì)抗炎癥[3]、抗氧化[4]、抗腦血管痙攣以及抑制血小板聚集[5]的作用。然而他汀類藥物對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的作用和機(jī)制尚未闡明。本研究探討瑞舒伐他汀對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物處理 實(shí)驗(yàn)中所用81只新西蘭白兔購(gòu)自無(wú)錫太湖醫(yī)院動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前對(duì)白兔投喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，飼養(yǎng)于正常濕度和完成22 ℃室溫下。瑞舒伐他汀的喂服劑量為5 mg/(kg·d)。在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型完成之前3 d和22 h之后測(cè)定白兔血壓和體重，并給予瑞舒伐他汀灌胃，每日1次。在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型完成后第24小時(shí)評(píng)價(jià)白兔神經(jīng)損傷狀況，之后立即處死白兔。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)將81只白兔分為3組：假手術(shù)組、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(出血組)和瑞舒伐他汀治療組(治療組)，各27只。治療組灌服瑞舒伐他汀方法如前述。通過(guò)灌注固定處死每組各9只白兔，取各組處死白兔的海馬體進(jìn)行原位末端標(biāo)記染色；再取每組各9只白兔，進(jìn)行腦組織水含量檢測(cè)；最后的每組各9只白兔處死后取出腦組織，干燥冷凍，用于檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)。在處死白兔前，通過(guò)股靜脈抽取各組白兔血液標(biāo)本進(jìn)行內(nèi)皮素1(ET-1)檢測(cè)。

1.3 蛛網(wǎng)膜下腔出血模型制備 利用10%的水合氯醛對(duì)白兔進(jìn)行麻醉。在無(wú)菌條件下，用23號(hào)蝴蝶針穿刺至小腦延髓池，在流出1 mL腦脊液時(shí)，說(shuō)明穿刺針進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，注入2 mL未抗凝的自體血液。所有白兔均采取低頭30°角體位30 min，以確保血液從小腦延髓池順利進(jìn)入基底池。之后將白兔送回動(dòng)物房，并于48 h后進(jìn)行第2次注血，方法同前。

1.4 行為評(píng)分 對(duì)所有的白兔進(jìn)行行為評(píng)分，評(píng)價(jià)神經(jīng)功能，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)表1。

表1 行為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 腦組織含水量檢測(cè) 在處死白兔后獲取腦組織立即稱重，之后將腦組織置于100 ℃下24 h，再次稱重。依據(jù)公式(濕重-干重)/濕重×100%計(jì)算腦組織含水量百分比。

1.6 灌注-固定腦組織 將每組各8只白兔應(yīng)用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。之后迅速開(kāi)胸，在白兔左心室進(jìn)行插管，并切開(kāi)右心房。先用1 500 mL生理性磷酸鹽緩沖液灌注，之后應(yīng)用1 000 mL 10%甲醛緩沖液灌注。灌注完成后，腦組織將固定于甲醛溶液中。

1.7 細(xì)胞及生化指標(biāo)檢測(cè) 細(xì)胞凋亡采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)ET-1；采用Western blot檢測(cè)水孔蛋白4和半胱天冬酶3。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 在實(shí)驗(yàn)間隔期和實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，各組血壓和體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蛛網(wǎng)膜下腔出血組死亡率為33.3%(9/27)，治療組死亡率為18.5%(5/27)，假手術(shù)組無(wú)死亡白兔。治療組死亡率顯著低于蛛網(wǎng)膜下腔出血組(P<0.05)。在構(gòu)建模型的過(guò)程中，根據(jù)死亡數(shù)據(jù)補(bǔ)充新的白兔進(jìn)行造模。

2.2 行為評(píng)分 出血組和治療組的行為評(píng)分均顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，而治療組的行為評(píng)分顯著低于出血組(P<0.05)。表明瑞舒伐他汀能夠提高蛛網(wǎng)膜下腔出血后白兔的神經(jīng)功能。詳見(jiàn)圖1。

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與出血組比較，#P<0.05。

圖1各組行為評(píng)分比較

2.3 腦組織水含量 出血組和治療組腦組織水含量較假手術(shù)組顯著增加(P<0.01)，而治療組腦組織水含量顯著低于出血組(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2。

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與出血組比較，#P<0.01。

圖2各組腦組織水含量比較

2.4 原位末端標(biāo)記染色和死亡細(xì)胞檢測(cè) 假手術(shù)組中原位末端標(biāo)記染色幾乎未見(jiàn)到染色陽(yáng)性細(xì)胞。治療組和出血組染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著多于假手術(shù)組，而治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于出血組。詳見(jiàn)圖3。

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與出血組比較，#P<0.05。

圖3各組海馬體神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.5 ET-1蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，出血組和治療組ET-1蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)。而治療組顯著低于出血組(P<0.01)。詳見(jiàn)圖4。

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與出血組比較，#P<0.01。

圖4各組腦組織ET-1表達(dá)水平比較

2.6 水孔蛋白4表達(dá) 出血組水孔蛋白4表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；而治療組顯著降低了蛛網(wǎng)膜下腔出血引起水孔蛋白4表達(dá)，與出血組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖5。

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與出血組比較，#P<0.05。

圖5各組水孔蛋白4表達(dá)水平比較

2.7 半胱天冬酶3表達(dá) 蛛網(wǎng)膜下腔出血顯著增加了半胱天冬酶3在海馬體中的表達(dá)，而治療組半胱天冬酶的表達(dá)水平顯著低于出血組(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6。

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與出血組比較，#P<0.05。

圖6各組半胱天冬酶3表達(dá)水平比較

3 討 論

瑞舒伐他汀是一種羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，前期相關(guān)研究證實(shí)他汀類藥物具有對(duì)抗炎癥、抗氧化、抗腦血管痙攣以及抑制血小板聚集的作用。蛛網(wǎng)膜下腔出血引發(fā)的早期腦損傷機(jī)制包括顱內(nèi)壓升高，氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎癥，血腦屏障破壞和腦缺血。本研究探討瑞舒伐他汀對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的作用和分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中采取二次注血的方式構(gòu)建了蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，過(guò)程中，假手術(shù)組未見(jiàn)動(dòng)物死亡，而出血組和治療組分別發(fā)生9例和5例動(dòng)物死亡，兩組動(dòng)物死亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示瑞舒伐他汀能夠增加蛛網(wǎng)膜下腔出血白兔的耐受性，降低其死亡率。本研究結(jié)果顯示，出血組和治療組行為評(píng)分較假手術(shù)組升高，而治療組行為評(píng)分顯著低于出血組。表明瑞舒伐他汀能改善蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙。通過(guò)比較各組白兔實(shí)驗(yàn)后的腦組織水含量，證實(shí)了蛛網(wǎng)膜下腔出血后又發(fā)生了顯著的腦水腫，而瑞舒伐他汀能夠減輕腦水腫，進(jìn)而改善神經(jīng)功能。原位末端標(biāo)記染色顯示，與假手術(shù)組比較，出血組和治療組海馬體神經(jīng)元細(xì)胞死亡數(shù)顯著增加，而瑞舒伐他汀可降低神經(jīng)元細(xì)胞死亡數(shù)。以上結(jié)果表明，瑞舒伐他汀能夠在蛛網(wǎng)膜下腔出血早期減輕腦水腫，降低神經(jīng)元細(xì)胞死亡，改善神經(jīng)功能，增加白兔對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔出血的耐受性。

ET-1能夠與平滑肌上的特殊受體結(jié)合，引發(fā)血管收縮和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，這一過(guò)程能夠破壞體內(nèi)水平衡，加重蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦水腫[6]。相關(guān)研究證實(shí)，水孔通道蛋白4促進(jìn)腦水腫過(guò)程中的水聚集，加重腦水腫癥狀[7]。本研究結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀可降低蛛網(wǎng)膜下腔出血白兔的腦組織ET-1和水孔通道蛋白4表達(dá)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。蛛網(wǎng)膜下腔出血早期損傷中伴隨神經(jīng)元細(xì)胞壞死和凋亡。本研究檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子半胱天冬酶3，證實(shí)在蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游镏邪腚滋於?顯著升高，而瑞舒伐他汀能降低半胱天冬酶3水平。表明瑞舒伐他汀可能通過(guò)抑制半胱天冬酶3表達(dá)來(lái)抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血白兔神經(jīng)元細(xì)胞死亡。

綜上所述，瑞舒伐他汀能夠通過(guò)抑制ET-1、水孔通道蛋白4和半胱天冬酶3的表達(dá)來(lái)抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血腦組織水腫和神經(jīng)元壞死，改善早期腦損傷預(yù)后。