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        利心沖劑改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝的作用機制研究

        2018-10-12 04:36:06,,
        關(guān)鍵詞:沖劑勻漿低劑量

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        進(jìn)入21世紀(jì)以來,各種心臟疾病導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)病率仍然呈上升趨勢。近年來,調(diào)節(jié)衰竭心肌細(xì)胞能量代謝受到關(guān)注,有望成為治療心力衰竭的一種新策略[1]。研究顯示,心肌組織沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白(silent information regulator 2 homolog,Sirt1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gammaco-activator,PGC-1α)是參與心肌能量代謝的重要物質(zhì),本研究觀察中藥利心沖劑調(diào)控心力衰竭大鼠模型心肌Sirti/PGC-1α的表達(dá),探討利心沖劑改善心肌細(xì)胞能量代謝的機制。

        1 材料與方法

        1.1 藥品與試劑 利心沖劑:由黃芪、黃精、補骨脂、葶藶子、益母草按10∶5∶4∶4∶10的比例組成,采用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的免煎顆粒。

        試劑:磷酸肌酸(creatine phosphat,PCr)Elisa試劑盒,由上海源葉生物科技有限公司提供,批號:1600526。Sirt1抗體,由SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC公司提供,批號:A1324;PGC-1α抗體,由SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC公司提供,批號:A6384。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 動物 SPF級健康SD大鼠80只,雄性,體重200 g~260 g,由浙江省實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(浙)2014-0001。

        1.2.2 造模及分組 參照文獻(xiàn)[2],采用腹主動脈縮窄法制備心臟壓力負(fù)荷超載心力衰竭模型:SD大鼠術(shù)前禁食8 h,稱重,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,常規(guī)備皮消毒,逐層打開腹腔,左側(cè)腎動脈上方游離腹主動脈,將8號注射器針頭磨鈍,平行置于腹主動脈上,用4號手術(shù)線將腹主動脈和注射器針頭一同結(jié)扎,然后緩慢撤出注射器針頭,關(guān)腹,分層縫合。假手術(shù)組僅開腹游離腹主動脈,穿線不結(jié)扎。術(shù)后予青霉素腹腔注射5 d,預(yù)防感染。手術(shù)成功2周后從存活大鼠中隨機選取大鼠2只,斷頭處死,取出心臟,用預(yù)冷生理鹽水沖洗,取左心室心肌部分,以10%甲醛固定,HE染色,光鏡下觀察確認(rèn)造模成功。

        造模成功后將SD大鼠隨機分為4組,每組10只。假手術(shù)組、模型組給予等體積雙蒸水;利心沖劑低劑量組(低劑量組)給予利心沖劑20 g/kg;利心沖劑高劑量組(高劑量組)給予利心沖劑40 g/kg。各組大鼠灌胃給藥,每日1次,連續(xù)3個月。末次給藥后大鼠脫頸處死,取左心室心肌組織,-70 ℃溫箱保存?zhèn)溆茫瑱z測相關(guān)指標(biāo)。

        1.3 觀察項目及檢測方法

        1.3.1 心肌勻漿PCr檢測 稱取左室心肌組織1 g,以2∶1比例加入冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS,4 ℃),勻漿器迅速制備心肌勻漿,3 000 r/min離心5 min,取上清,-70 ℃溫箱保存。按PCr ELLSA檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行。

        1.3.2 Western-Blot法測定心肌勻漿Sirt1、PGC-1α蛋白表達(dá) 冰上裂解組織,手持式勻漿器勻漿,勻漿后BCA法測定各樣本的蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度計算各樣本電泳時的上樣量。使用10%預(yù)制SDS-PAVE凝膠,上樣本后以恒壓110 V進(jìn)行凝膠電泳,電泳結(jié)束后,以恒壓120 V進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉,之后孵育第一抗體,4 ℃過夜,清洗后孵育第二抗體2 h,凝膠成像系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光成像,保存數(shù)據(jù)為圖片,應(yīng)用Quantity One對各條帶進(jìn)行分析,計算出相對值后導(dǎo)出Excel表格做進(jìn)一步統(tǒng)計。

        2 結(jié) 果

        2.1 利心沖劑對心力衰竭大鼠心肌勻漿PCr的影響 與假手術(shù)組比較,模型組、利心沖劑低劑量組及利心沖劑高劑量組PCr含量均顯著降低(P<0.05),提示心力衰竭時細(xì)胞內(nèi)PCr含量呈下降趨勢;與模型組比較,利心沖劑高劑量組PCr明顯升高(P<0.05),說明利心沖劑治療能夠提高細(xì)胞中的PCr水平。詳見表1。

        表1 各組大鼠PCr含量比較(±s)

        2.2 利心沖劑對心力衰竭大鼠心肌組織Sirt1蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較,模型組、利心沖劑治療組中Sirt1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01),說明心力衰竭時心肌組織內(nèi)Sirt1的含量呈下降趨勢;與模型組比較,利心沖劑低劑量組與高劑量組中Sirt1蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01),提示利心沖劑可以提高Sirt1表達(dá)水平。詳見圖1、圖2。

        圖1 Sirt1蛋白表達(dá)電泳圖

        與假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

        圖2 Sirt1蛋白表達(dá)相對定量柱狀圖

        2.3 利心沖劑對心力衰竭大鼠心肌組織PGC-1α蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較,模型組、利心沖劑治療組中PGC-1α蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01),說明心力衰竭時心肌組織內(nèi)PGC-1α的含量呈下降趨勢,與模型組比較,利心沖劑低劑量組與高劑量組中PGC-1α蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01),提示利心沖劑可以提高PGC-1α表達(dá)水平。詳見圖3、圖4。

        圖3 PGC-1α蛋白表達(dá)電泳圖

        與假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

        圖4 PGC-1α蛋白表達(dá)相對定量柱狀圖

        3 討 論

        心力衰竭是各種心臟疾病的嚴(yán)重和終末階段,是世界范圍內(nèi)突出的公共衛(wèi)生問題[3]。近20余年,心力衰竭的治療模式已經(jīng)從改善血流動力學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种粕窠?jīng)內(nèi)分泌的過度激活,并取得了長足的進(jìn)步。目前的治療雖然延緩了心力衰竭的進(jìn)程,但并未使得心力衰竭致殘率和病死率明顯下降。人們逐漸認(rèn)識到能量代謝貫穿于心肌從肥大到衰竭的全過程,是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展、惡化的重要因素之一[4-5]。

        心肌正常的能量代謝是維持心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和心臟舒縮功能的基礎(chǔ)[6],三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)和PCr參與了心肌能量代謝,其中ATP是直接的供能物質(zhì),PCr是主要的能量儲備。能量底物在線粒體通過三羧酸循環(huán)氧化磷酸化為ATP,后者被肌酸激酶(creatine kinase,CK)轉(zhuǎn)移并儲存在PCr中,PCr能在肌酸激酶的催化下及時轉(zhuǎn)化為ATP,補充心肌收縮時不斷消耗的ATP[7]。心力衰竭時ATP的合成受限,細(xì)胞內(nèi)ATP耗竭,PCr水平下降,心肌處于“能量饑餓狀態(tài)”[8]。Sirt1是酵母染色質(zhì)沉默子Sirt2在哺乳動物中的同源體1,具有組蛋白去乙酰化酶活性[9],與基因轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞生長周期調(diào)節(jié)、能量代謝及壽命期限延長有著密切的關(guān)系,還通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝、活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生、血管生成、細(xì)胞自噬及死亡等過程,在心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中起著重要的作用[10]。近年研究發(fā)現(xiàn),PGC-1α是線粒體生物合成的中樞調(diào)節(jié)因子[11],可促進(jìn)線粒體生物合成,增強不同組織細(xì)胞有氧呼吸功能,而線粒體參與了心臟能量產(chǎn)生和新陳代謝等重要生理過程,其功能障礙是導(dǎo)致心功能惡化的主要因素之一。Sirt1能夠通過去乙?;饔眉せ頟GC-1α,促進(jìn)線粒體的生物合成,調(diào)節(jié)線粒體的功能,從而調(diào)節(jié)能量代謝障礙、協(xié)調(diào)心臟舒縮功能,發(fā)揮心肌保護(hù)作用[12]。Sirt1/PGC-1α途徑調(diào)控的線粒體功能可能是維持和修復(fù)心肌細(xì)胞的主要機制之一,在心力衰竭、心肌肥大等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。

        慢性心力衰竭歸屬于中醫(yī)“胸痹”“喘證”等范疇,基本病機概括為心氣虛乏,心陽式微,瘀阻水停,其主要病理變化是虛、瘀、飲[13-14]。治宜益氣溫陽、活血利水。利心沖劑(黃芪、黃精、補骨脂、葶藶子、益母草)針對氣陽虛乏、絡(luò)脈瘀阻、水濕停聚三大基本病理變化,以黃芪和黃精補益心氣,補骨脂溫陽化氣,振奮心腎氣陽治其本;黃芪益氣利水,益母草活血利水,葶藶子瀉肺利水,通利水停瘀阻治其標(biāo)。前期臨床對照研究證實,與單純西藥治療比較,利心沖劑干預(yù)后病人生活質(zhì)量、射血分?jǐn)?shù)改善明顯,B型利鈉肽(BNP)下降[15];作用機制研究也顯示,利心沖劑能改善大鼠心力衰竭模型心肌病理和血流動力學(xué);減少大鼠心肌組織神經(jīng)內(nèi)分泌因子的表達(dá),降低血清血管緊張素Ⅱ水平;抑制心肌細(xì)胞凋亡;調(diào)控心肌組織金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)的表達(dá)、抑制由轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)誘導(dǎo)的心肌膠原沉積和纖維化[16-17]。

        本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組、利心沖劑低劑量組及利心沖劑高劑量組PCr含量均顯著降低(P<0.05),表明心力衰竭大鼠存在能量代謝障礙;與模型組比較,利心沖劑高劑量組PCr明顯升高(P<0.05),說明利心沖劑改善了心力衰竭大鼠的心肌能量代謝。模型組Sirt1及PGC-1α顯著下降,經(jīng)利心沖劑干預(yù)后,Sirt1及PGC-1α水平明顯上升,提示利心沖劑可能通過Sirt1/PGC-1α途徑,促進(jìn)線粒體增殖,從而調(diào)節(jié)線粒體的能量合成,改善了心肌細(xì)胞的能量代謝。中醫(yī)藥改善心肌能量代謝障礙或?qū)⒊蔀槁孕牧λソ咝碌难芯糠较颉?/p>

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