朱辰奇，錢(qián) 晨，徐 柳，陳 瑞,胡榮峰，陳志鵬

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京210023；2.蘇州市立醫(yī)院本部藥劑科,江蘇蘇州215002；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230038)

近年來(lái)，惡性腫瘤的治療仍然是困擾人類的一個(gè)重大難題?；熓悄[瘤治療中最主要的手段，但傳統(tǒng)化療藥物的靶向性和特異性較差，對(duì)正常組織和細(xì)胞會(huì)造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，非常有必要開(kāi)發(fā)高特異性的藥物遞送系統(tǒng)，這對(duì)研究者來(lái)說(shuō)也是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[1]。

納米載藥系統(tǒng)因其獨(dú)特的高滲透、長(zhǎng)滯留效應(yīng)(EPR)在腫瘤治療中[2-4]具有很好的前景。因此，眾多優(yōu)良的納米載體被不斷地開(kāi)發(fā)出來(lái)，比如介孔二氧化硅[5]、氧化石墨烯[6]、碳納米管[7]、金納米載體[8]和磁性納米載體[9]等。

納米有機(jī)載體因其低毒性、高生物相容性和可降解性的優(yōu)點(diǎn)，受到了研究人員的青睞。聚乙二醇(PEG)[10]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)[11]、人血清白蛋白[12]和脂質(zhì)體[13]等有機(jī)材料作為納米載體已經(jīng)獲得批準(zhǔn)，并在臨床上得到廣泛的運(yùn)用。這些載體通過(guò)結(jié)合多肽、配體等靶向基團(tuán)的修飾，可進(jìn)一步提高其特異性，聚集于腫瘤部位[14-15]，但是這些帶有靶向基團(tuán)的納米載體制備難度和成本較高[16]，且由于人體自身存在的血液、腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞等屏障[17]，達(dá)到腫瘤部位的載體數(shù)量十分有限[18-19]。

生物載體，如細(xì)菌載體，能夠克服多重生理屏障，并且可以通過(guò)基因工程獲得特定的靶向功能，這引起了研究人員的興趣[20]。細(xì)菌或者細(xì)菌衍生物首次作為載體用于遞送系統(tǒng)的研究可以追溯到20世紀(jì)90年代中期，Wells等[21]將食物中的乳酸菌用作黏膜疫苗的載體。不同種類的細(xì)菌，如梭狀芽胞桿菌(Clostridiumnovyi)[22]、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)[23]、大腸桿菌(Escherichiacoli)[24]、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)[25]和乳酸菌(lactic-acid bacteria)[26]，作為載體被應(yīng)用于癌癥、糖尿病和結(jié)腸炎等疾病的治療研究，得到了很多臨床試驗(yàn)的證明[27]。但是，活菌作為一個(gè)外來(lái)體，直接作為載體時(shí)容易引起人的免疫反應(yīng)，內(nèi)毒素的存在也可能引起宿主細(xì)胞的毒性反應(yīng)。而細(xì)菌衍生物相對(duì)于活菌來(lái)說(shuō)具有低免疫原性、低毒性的特點(diǎn)，并且其制備工藝簡(jiǎn)單，可大規(guī)模生產(chǎn)，因此，其作為載體應(yīng)用于遞釋系統(tǒng)具有很好的前景。以下就常見(jiàn)的細(xì)菌衍生物——細(xì)胞外膜囊泡、微細(xì)胞和細(xì)胞原生質(zhì)體囊泡作為遞釋系統(tǒng)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)

1.1 OMVs的來(lái)源及組成

細(xì)菌會(huì)在生長(zhǎng)過(guò)程中的各個(gè)階段自然地將細(xì)胞膜上的納米脂蛋白分泌到膜外[28]，這種分泌囊泡的現(xiàn)象雖然被發(fā)現(xiàn)了40多年[29]，但是近幾年研究人員才發(fā)現(xiàn)這是細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中的普遍現(xiàn)象，尤其是細(xì)菌受到外界刺激時(shí)[30]，更易分泌各種囊泡。這些囊泡的直徑在20～250 nm，通常是球形[31]，主要是由革蘭氏陰性菌中細(xì)菌的外膜(outer membrane,OM)釋放出來(lái),因此被命名為OMVs[32]。近年，在少數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌中也有OMVs存在的報(bào)道[33]。

由于細(xì)菌超強(qiáng)的變異性，當(dāng)前對(duì)OMVs的產(chǎn)生機(jī)制還不明確。主要有3種假說(shuō):①Wensink等[34]提出，在OMVs的生物合成過(guò)程中，OM相對(duì)于肽聚糖底層生長(zhǎng)更快，導(dǎo)致兩層之間的共價(jià)鍵被破壞，并開(kāi)始形成囊泡；②Mcbroom等[35]提出，由于細(xì)胞周質(zhì)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和肽聚糖片段不斷地累積，對(duì)OM施加了一種向外的壓力，OM最終膨脹至破裂并釋放出囊泡；③Schertzer等[36]提出，OMVs的形成是由于細(xì)胞外小葉不均勻延伸。雖然OMVs產(chǎn)生和調(diào)控背后的機(jī)制途徑和功能原因暫時(shí)還不明確，但是它們?cè)诩?xì)胞間信息交流、基因轉(zhuǎn)移及毒力因子、抗原和毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)等作用已經(jīng)得到了證實(shí)[37-42]。

大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌OM的主要組成部分是脂多糖，因此，它們的OMVs是免疫細(xì)胞的一種非常有效的激活劑。OMVs可以引導(dǎo)正常的宿主細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答，可以應(yīng)用于疫苗和佐劑的開(kāi)發(fā)。另一方面，在藥物遞送的過(guò)程中，理想的載體應(yīng)該是非免疫原性或者非炎性的，避免引起患者炎癥反應(yīng)。常見(jiàn)的可以有效降低細(xì)菌OMVs免疫原性的策略包括：①選擇非致病性細(xì)菌；②通過(guò)基因工程，移除、添加或修改產(chǎn)生OMVs菌株的膜蛋白和表面抗原[43]。

1.2 OMVs在藥物遞釋系統(tǒng)中的應(yīng)用

在某些情況下，自然產(chǎn)生的OMVs可以直接作為遞藥載體，例如：用細(xì)菌的OMVs裝載免疫調(diào)節(jié)分子或者抗菌肽，OMVs通過(guò)黏附或者融合的方式將裝載的藥物遞送到靶細(xì)菌。通過(guò)融合蛋白，可以溶解或者殺死靶細(xì)菌，Kadurugamuwa等[44]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌囊泡包含自溶素——胞壁質(zhì)水解酶，其能夠裂解其他革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。利用這一特性可以將OMVs制成抗生素載體來(lái)殺死致病菌。

OMVs來(lái)自于不同的細(xì)菌種類，所以會(huì)展現(xiàn)出一系列不同的生物學(xué)效應(yīng)。利用生物工程技術(shù)，分離出來(lái)的OMVs表面可以結(jié)合特定的配體，如抗體、細(xì)胞靶向肽、寡核苷酸適配體或抗原等，通過(guò)分子適應(yīng)或體外生物綴合技術(shù)形成靶向納米載藥系統(tǒng)。利用基因工程技術(shù)，編碼OMVs細(xì)菌的細(xì)胞外膜表面或者其他膜結(jié)合蛋白的特定序列，從而產(chǎn)生可以靶向宿主細(xì)胞或組織的OMVs。Gujrati等[45]利用ClyA的尋址特性在大腸桿菌OMVs上表達(dá)對(duì)原癌基因人類表皮因子受體2(HER2)高親和力的HER2配體(AffiHER2OMVs)，如圖1所示。HER2是一種具有絡(luò)氨酸激酶活性的跨膜受體，其會(huì)在乳腺癌、卵巢癌及胃癌等腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)[46-47]。利用其對(duì)HER2的靶向，Gujrati[45]將裝載siRNA的OMVs遞送到腫瘤細(xì)胞，成功地使目標(biāo)基因沉默，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖1 表達(dá)HER2特異性親和體的OMV的示意圖[45]Fig.1 Schematic representation of OMVs expressing HER2-specific affibody (AffiHER2OMV)[45]

1.3 OMVs裝載DNA的機(jī)制

核酸運(yùn)用于腫瘤的治療[48]是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，OMVs可以用來(lái)傳遞DNA[49]，但是關(guān)于DNA的裝載機(jī)制還存在很多爭(zhēng)議。Renelli等[50]在2004年提出的模型中，細(xì)菌裂解后釋放的細(xì)胞外DNA通過(guò)類似于細(xì)菌轉(zhuǎn)化中使用的機(jī)制被內(nèi)化在囊泡中，通過(guò)檢測(cè)出OMVs中的“裸”質(zhì)粒DNA來(lái)證實(shí)這個(gè)模型。他們還提出外源DNA可能通過(guò)打開(kāi)和關(guān)閉一小部分OMVs來(lái)內(nèi)化，但是檢測(cè)到的DNA數(shù)量并不能完全證實(shí)這個(gè)猜想。

2010年Mashburn-Warren等[51]提出，在細(xì)菌OMVs釋放前，DNA是以某種方式從細(xì)胞質(zhì)透過(guò)質(zhì)膜再直接被OMVs包封，然而支持這個(gè)模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還不夠充分。

另一個(gè)是Pérez-Cruz等[52]在2013年通過(guò)高壓冷凍和冷凍置換(HPF-FS)的透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)，觀察到了北極泡狀希瓦氏菌M7T會(huì)產(chǎn)生雙層的OMVs，通過(guò)蛋白組學(xué)研究證實(shí)了該菌株的OMVs中存在質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，并使用免疫金滲濾法證實(shí)了囊泡內(nèi)DNA的存在。他們的研究也證實(shí)了Kadurugamuwa等[53]在1995年提出的觀點(diǎn)，肽聚糖層可以被自溶素降解，這種短暫和局部的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌形成OMVs，OMVs中包含了DNA等物質(zhì)。

2 細(xì)菌原生質(zhì)體囊泡(bacterial protoplast-derived nanovesicles，PDNVs)

2.1 PDNVs的來(lái)源及組成

PDNVs是指細(xì)菌去除細(xì)胞壁剩下的部分[54]，制備PDNVs的方法較多，例如，酶降解[55]或用基因工程阻止細(xì)胞壁的合成[56]等。雖然PDNVs的毒性較小，目前還沒(méi)有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其是否對(duì)人體存在安全性問(wèn)題[55-56]，但是，它可以作為一個(gè)多功能的載體，容納不同特性的分子，如蛋白質(zhì)、化學(xué)物質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。

2.2 PDNVs在藥物遞釋系統(tǒng)中的應(yīng)用

Kim等[54]利用大腸桿菌制成了無(wú)毒的PDNVs(圖2)，以此作為疫苗的載體，比目前的疫苗載體引起更強(qiáng)的抗原特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，更重要的是，PDNVs可以避免因細(xì)菌抗原引起的小鼠敗血癥，利用這些特性，PDNVs能在腫瘤免疫療法中有很大的潛力。

腫瘤細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)會(huì)過(guò)度表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)[58-59]，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)可以作為PDNVs的靶向部分，以靶向腫瘤細(xì)胞表面的表面生長(zhǎng)因子受體。2017年， Kim等[60]設(shè)計(jì)并制造了表達(dá)EGFR的大腸桿菌原生質(zhì)體納米囊泡(EGFR-PDNV)，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中以此來(lái)載藥的EGFR-PDNV都能有效地將藥物遞送至小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并且沒(méi)有發(fā)生有害反應(yīng)。同時(shí)，他們提出了新的研究方向：①使用GE11肽或者HER2結(jié)合親和體分子作為靶向部分；②用聚乙二醇覆蓋PDNVs，延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間。

圖2 PDNVs和載入抗原的PDNVs制備的示意圖[57]Fig.2 Schematicdiagram of PDNVs and antigen-loaded PDNVs preparation[57]

3 微細(xì)胞(minicells)

3.1 微細(xì)胞的來(lái)源和組成

MacDiarmid等[61]發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌可以通過(guò)minCDE蛋白產(chǎn)生染色體缺失的突變體——微細(xì)胞， minCDE蛋白通過(guò)抑制FtsZ來(lái)控制正常細(xì)菌的細(xì)胞分裂[62](圖3)。雖然這些微細(xì)胞直徑一般為(400±20) nm[58]，但是De Jong等[63]發(fā)現(xiàn)一個(gè)微細(xì)胞中可以裝載多達(dá)一百萬(wàn)個(gè)藥物分子。

微細(xì)胞形態(tài)上呈一個(gè)穩(wěn)定的圓形，依然保持著由20多種脂多糖(內(nèi)毒素)組成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[64]，類似于親代細(xì)菌。同時(shí)，微細(xì)胞有其親代細(xì)胞的除了染色體DNA以外的所有成分。

Lee等[65]用谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)產(chǎn)生無(wú)內(nèi)毒素的微細(xì)胞。谷氨酸棒狀桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，其符合美國(guó)FDA食品添加劑的安全性指標(biāo)。乳酸菌是一種有益菌，乳酸菌的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞壁主要由肽聚糖、磷壁酸、蛋白質(zhì)和多糖組成[66]。Giacalone等[64]將乳酸菌的微細(xì)胞作為遞藥載體，實(shí)驗(yàn)證明其具有很好的安全性和生物相容性。

3.2 微細(xì)胞在藥物遞釋系統(tǒng)中的應(yīng)用

微細(xì)胞可以通過(guò)EGFR、人類表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅱ(ERBB2)、CD33或CD3的雙特異性抗體靶向腫瘤細(xì)胞[45,67]。微細(xì)胞通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，裝載阿霉素的微細(xì)胞能夠抑制小鼠體內(nèi)乳腺、卵巢或肺部腫瘤生長(zhǎng)[61]。Solomon等[68]已經(jīng)進(jìn)行了裝載紫杉醇的微細(xì)胞的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，其表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，并且沒(méi)有導(dǎo)致促炎性因子的增加。MacDiarmid等[69]以17個(gè)不同品種的帶有晚期腦腫瘤的狗為模型，證明了微細(xì)胞載藥體系在腦腫瘤靶向和治療方面的巨大潛力。

Vinh等[70]和Nguyen等[71-72]將鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)和嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)通過(guò)葡萄糖和果糖產(chǎn)生最大尺寸小于400 nm的微細(xì)胞，并將其用于遞送順鉑、紫杉醇和頭孢菌素。MacDiarmid等[61]成功把siRNA和shRNA包封入來(lái)自鼠傷寒沙門(mén)氏菌的微細(xì)胞中，并通過(guò)BsAb靶向EGFR。Jivrajani等[73]利用由葉酸來(lái)修飾包封shRNA的微細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞，再釋放shRNA抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)，如圖3所示。

圖3 FAminicellsVEGFA制備的示意圖[73]Fig.3 Preparation of FA minicellsVEGFA[73]

4 結(jié)論與展望

細(xì)菌載體的出現(xiàn)為納米載藥系統(tǒng)的研發(fā)提供了新思路，為腫瘤治療提供新的途徑。其中，細(xì)菌衍生物載體具有更好的操控性和安全性，并在實(shí)驗(yàn)中有很好的表現(xiàn)。但細(xì)菌衍生物載體畢竟還是一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，很多細(xì)菌衍生物產(chǎn)生的機(jī)制和載藥的機(jī)制尚不明確，如何高效地把載體靶向至腫瘤組織或細(xì)胞，如何降低或消除細(xì)菌衍生物的毒性，這些問(wèn)題都是未來(lái)的研究難點(diǎn)和重點(diǎn)。相信隨著生物工程技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，細(xì)菌衍生物載體技術(shù)會(huì)越來(lái)越成熟，最終運(yùn)用至腫瘤患者的臨床治療中。