邢建宇，申 宇，馮冬冬

(1.長安大學環(huán)境科學與工程學院，陜西西安710054；2.長安大學旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應教育部重點實驗室，陜西西安710054)

明膠是膠原蛋白水解后的產物，因其具有原料易得、制備工藝簡單、生物可降解性強及生物兼容性好等特點，使得明膠廣泛應用于食品、醫(yī)藥和組織工程材料等多個領域[1-3]。但是以往的研究及應用主要集中于利用明膠生物降解性強、生物兼容性好的特點，而對于明膠在使用過程中的結構變化以及由此對于合成材料整體上理化性質的影響關注較少。

明膠的變性溫度約為35 ℃，其無規(guī)則卷曲轉變?yōu)槁菪Y構的過程可分為兩個階段，當冷卻開始時，螺旋結構的形成速率較快，持續(xù)幾分鐘，然后進入一個較長的慢速率時期，最終達到膠原狀態(tài)的平衡。與其他具有螺旋結構的生物多聚體(如，多糖、DNA等)相比，明膠的復性速率相對較慢，這主要是由于大量存在的肽鍵需要高的活化能(約72 kJ/mol)進行順反異構反應以形成三螺旋結構[4]。當高于變性溫度的明膠無規(guī)則卷曲被冷卻時，部分的明膠鏈可以復性到螺旋狀態(tài)及三螺旋狀態(tài)，但是復性的程度取決于很多因素，如濃度、溫度、壓力、溶劑以及有無化學交聯(lián)劑[5-8]。Gandhi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在攪拌的條件下，高于變性溫度存在的明膠無規(guī)則卷曲，可部分復性為螺旋結構，因此在體積上呈現(xiàn)大的差異，并將該種復性歸結于攪拌條件下明膠鏈的伸展與定向排列。除了復性帶來的體積上的變化外，明膠復性還會帶來其力學性能方面的提高，影響其在生物材料中的應用[10]。

α-螺旋多肽的生物學功能主要是由分子軸上大的宏觀偶極矩(每個氨基酸殘基的偶極矩大約為11.669×10-30C·m)引起的，而且偶極產生靜電場，并在氨基端產生正電荷、在羧基端產生負電荷。α-螺旋多肽大偶極距在生物體系中蛋白質的結構和功能方面起著非常重要的作用。目前在很多非等軸材料研究中，已經將注意力集中在有助于分子排列調節(jié)的靜電作用上[14]。研究結果表明，外加靜電場的存在，確實有助于α-螺旋多肽分子的排列，對于電場中的多肽分子具有一定的導向作用[15-17]。但是，目前的研究主要集中在采用接觸式電場作用的影響，即通過電極表面多肽片段的排列來考察電場的影響，鑒于非接觸式靜電場在果蔬保藏方面的應用[18]，可以預見，在明膠溶液兩端施加非接觸式靜電場，將有助于明膠多肽分子微觀結構的伸展，對明膠的卷曲-螺旋結構轉化起到積極的輔助作用。

本文中，筆者擬在非接觸式靜電場的作用下研究明膠的螺旋-卷曲轉化，通過電場強度與濃度、溫度和溶劑的協(xié)同作用，考察電場作用對于明膠卷曲-螺旋變化的輔助作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

明膠(化學純)，國藥集團化學試劑有限公司；乙二醇(分析純)，天津市化學試劑六廠；WXG-4 型旋光儀，西安精科有限公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電源，北京六一儀器廠。實驗中所用的水均為美國Millipore公司生產純水儀所制的標準為18.2 Ω去離子水。

1.2 實驗方法

圖1為靜電場的構建示意圖。通過將8 cm×8 cm兩塊銅片平行放置，間距6 cm，并在銅片上施加電壓來實現(xiàn)。使用水及乙二醇溶液配制不同濃度明膠溶液，置于靜電場環(huán)境中，分別施加100、250和500 V電壓(對應電場強度分別為1 667、4 167和8 333 V/m)，測試并考察溶液旋光度的變化，明膠的結構改變會引起整體明膠溶液旋光度的改變，采用比旋光度法可測定明膠溶液中分子結構轉變[19]，每組實驗均做3個平行，最終數(shù)據(jù)取平均值。

比旋光度的計算公式為：[α]=α/Lρ。 其中，α為測得的旋光度(°)，L為溶液長度(dm)，ρ為溶液的質量濃度(g/mL)。

圖1 非接觸式靜電場的構建示意Fig.1 Diagram of non-contact electrostatic field construction

2 結果與討論

2.1 電場對明膠溶液卷曲-螺旋轉化的輔助作用

明膠溶液中螺旋組分的含量與溶液中旋光度成正比關系，且由于明膠為左旋化合物，故旋光度為負值。考察電場對明膠溶液卷曲-螺旋轉化的輔助作用，結果見圖2。由圖2可知，靜電場對室溫及冰浴條件下的明膠溶液均有不同程度的輔助作用。在室溫條件下，4 mg/mL明膠溶液的旋光度隨著時間的延長而增大，并在10 min以后趨于平衡。而平衡時的旋光度與電場強度關系密切，其數(shù)值隨著電場強度的升高而升高。冰浴條件下，由于溫度的降低，明膠溶液的旋光度數(shù)值變化很大，增幅約為17.25倍，遠高于常溫下8 333 V/m的靜電場對明膠的復性輔助作用。在冰浴的基礎上，電場的輔助作用更為明顯。冰浴條件下(圖2(b))，當電場強度1 667 V/m時，旋光度的數(shù)值有約30%的升高，而后隨著電場強度的升高，旋光度值趨于穩(wěn)定；當電場強度為4 167 V/m和8 333 V/m時，電場強度對明膠卷曲-螺旋轉化的輔助作用達到極限。

圖2 靜電場對明膠溶液旋光性的影響Fig.2 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin solution

2.2 靜電場對不同濃度明膠結構轉化的影響

考察電場強度對不同質量濃度(1、2、4和8 mg/mL)明膠結構轉化的影響，結果見圖3。從圖3可以看出：明膠溶液質量濃度為1 mg/mL時，溶液比旋光度受電場影響最大，說明此時單分子明膠的伸展由于受到電場的引導，從無規(guī)則卷曲結構達到伸展狀態(tài)，而隨著濃度的增加，明膠分子間作用力增強，電場的輔助作用依次減小，當質量濃度達到8 mg/mL時，比旋光度略有上升，此時可能由于濃度較大，明膠溶液中分子數(shù)量巨大，而并非由于電場的輔助作用引起的明膠結構改變導致的。

圖3 電場強度對不同濃度明膠結構轉化的影響Fig.3 Effects of electric field intensity on gelatin with different concentration

圖4 冰浴條件下靜電場對不同明膠濃度 明膠旋光性的影響Fig.4 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with different concentration in ice-bath

明膠溶液的旋光度變化與濃度、電場強度及溫度均相關。在冰浴條件下，考察電場強度對不同質量濃度(1、2、4和8 mg/mL)的明膠結構轉化的影響，結果見圖4。由圖4可知：電場引起的旋光度增量隨著濃度的升高也降低了約4.7倍。此結果表明，高濃度明膠溶液不利于明膠分子的伸展，所以無規(guī)則卷曲狀態(tài)向α-螺旋狀態(tài)的轉化受到抑制。已有的研究結果表明[17]，濃度不同的明膠溶液遵循不同的復性速率，稀溶液中，符合一級動力學模型，此時的復性機制可能主要為單鏈分子內的折疊復性，復性的速率與濃度無關。高濃度時，明膠分子的復性則復雜得多，不僅涉及分子內的折疊復性，還涉及分子間的相互作用，此時復性的過程是與濃度相關的。在冰浴條件下，靜電場的輔助作用對于低質量濃度明膠溶液(0.5 mg/mL)更加明顯，在冰浴條件下，8 333 V/m的電場強度對于0.5 mg/mL的復性增幅約為8 mg/mL條件下的5倍。

2.3 乙二醇溶液中電場強度對低濃度明膠的影響

乙二醇的添加，不僅會增大溶液體系的黏度，還可通過氫鍵作用維持明膠的構象?？疾煲叶既芤褐须妶鰪姸葘Φ蜐舛?1 mg/mL)明膠的影響，結果見圖5。由圖5可知：常溫下，當明膠質量濃度為1 mg/mL時，乙二醇體積分數(shù)的改變幾乎對明膠的復性行為沒有影響。但是當處于冰浴狀態(tài)下時，電場的輔助行為明顯升高，且電場的電場強度越大，變化的幅度越大。而乙二醇體積分數(shù)的升高，有利于通過肽-肽氫鍵作用維持已復性的螺旋結構[19]，故溶液旋光度的變化也依次升高。

圖5 乙二醇溶液中電場強度對低濃度明膠的影響Fig.5 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with low concentration in glycol solution

2.4 乙二醇溶液中電場強度對高濃度明膠的影響

考察乙二醇溶液中電場強度對高濃度(4 mg/mL)明膠的影響，結果見圖6。由圖6可知：當明膠質量濃度較高時，此時，明膠分子間較為擁擠，明膠的復性不僅涉及到分子內作用力，還涉及到分子間作用力，高濃度的明膠溶液不利于明膠分子的伸展，所以電場的導向牽引作用不易引起明膠分子的復性，電場輔助作用在常溫及冰浴條件下帶來的變化都不大。此時，乙二醇的體積分數(shù)變化對于明膠的復性維持作用同樣影響不大，并且明膠的復性作用與乙二醇的濃度并不呈線性關系，當乙二醇體積分數(shù)為50%時，電場引起的復性作用略高一些。

圖6 乙二醇溶液中電場強度對高濃度明膠的影響Fig.6 Effects of electrostatic field on optical rotation of gelatin with high concentration in glycol solution

3 結論

考察了靜電場對明膠結構轉化的影響，發(fā)現(xiàn)靜電場對明膠的卷曲-螺旋轉化隨著電場強度的升高而逐漸增強，隨著明膠濃度的增加而降低，且降低的程度與明膠分子間作用力關系密切。通過對溶劑的研究發(fā)現(xiàn)，電場作用對明膠的復性作用與溶劑有很大關系，低明膠濃度時，尤其是冰浴條件下，升高乙二醇體積分數(shù)有助于明膠的復性，而高濃度時，電場引起的輔助作用并不明顯，溶劑的影響也不明顯。