徐婷婷，遲 波，毛 春，徐 虹

(1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京211800；2.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院江蘇省生物功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210023)

組織工程學(xué)是一門(mén)以材料科學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)相結(jié)合、進(jìn)行體外或體內(nèi)構(gòu)建組織或器官的新興學(xué)科。通常情況下，從病人的身上直接提取細(xì)胞，在支架上進(jìn)行傳代和擴(kuò)增。通過(guò)適當(dāng)?shù)耐饨绱碳ぃ瑧?yīng)用化學(xué)、生物、機(jī)械和電子等手段，在較短時(shí)間內(nèi)形成新的組織。將這種新的組織重新植入病人體內(nèi)，幫助其功能重建[1]。因此，應(yīng)用于組織工程的支架必須滿足特定要求，包括：相互貫穿的高度多孔結(jié)構(gòu)，以滿足細(xì)胞黏附和增殖的需求[2]；三維支架結(jié)構(gòu)，最大化的模擬組織相關(guān)環(huán)境以便促進(jìn)細(xì)胞的粘附遷移，快速形成新的細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)組織生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸[3]。

聚氨酯是一類在高分子結(jié)構(gòu)主鏈上含有氨基甲酸酯基團(tuán)(—NHCOO—)的聚合物[4]，因其具有良好的生物相容性、優(yōu)異的力學(xué)性能、耐磨損及易加工成型等優(yōu)點(diǎn)，因此被應(yīng)用于人工心臟瓣膜、血管涂層和藥物控釋等眾多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。考慮到聚氨酯滿足組織工程學(xué)材料的一般要求，將其加以修飾改性制備多孔結(jié)構(gòu)聚氨酯，有望成為組織工程支架領(lǐng)域的熱門(mén)材料。目前，多孔結(jié)構(gòu)聚氨酯的制備方法包括靜電紡絲法、冷凍干燥法和相分離法等[5]。

肝素作為一種重要的抗凝藥物，常在臨床上用于減少醫(yī)用材料表面的血栓形成[6]。它與抗凝血酶Ⅲ有很強(qiáng)的作用力，從而可以防止纖維蛋白凝塊的形成。通過(guò)將肝素共價(jià)接枝在聚合物的表面，可以發(fā)揮長(zhǎng)效抗血栓功效[7]。與此同時(shí)，肝素可以與生長(zhǎng)因子等多種具有肝素結(jié)合域的蛋白相互作用，從而使生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合，確保其功能完好，免受水解作用的破壞[8]。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、分化、小管形成和生存中發(fā)揮積極作用，是觸發(fā)和調(diào)節(jié)血管生成的主要因素之一[9]。在眾多肝素特異性結(jié)合生長(zhǎng)因子中，VEGF可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，得到組織工程領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注。

本研究中，筆者采用肝素進(jìn)行多孔聚氨酯薄膜的功能化改性，并且進(jìn)一步采用VEGF對(duì)薄膜進(jìn)行修飾，以制備生物活性涂層，同時(shí)對(duì)該涂層的血液相容性和細(xì)胞相容性進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，希望促進(jìn)多孔聚氨酯組織工程材料在新生血管方向的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

聚氨酯R180A(PU,醫(yī)用級(jí))，蘇州科頌聚合物有限公司；二甲亞砜(DMSO)、丙烯酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；肝素(heparin)，Sigma中國(guó)有限公司；碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，曲拉通(X-100)，上海阿拉丁試劑有限公司。

RT-2204C型半自動(dòng)血凝儀，美國(guó)雷杜公司；BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；KH3200型超聲清洗儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；ESCALAB 250型X線光電子能譜(XPS)、Nicolet NEXUS670型紅外光譜儀,賽默飛世爾科技有限公司；SYNERGY2型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BX41型光學(xué)顯微鏡,日本奧林巴斯有限公司；SL200D型水接觸角儀，美國(guó)科諾工業(yè)有限公司； JMS-7600F型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社。

1.2 聚氨酯多孔膜的制備

稱取PU溶解于DMSO中，90 ℃機(jī)械攪拌24 h，配制成終質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的均相溶液。將溶液轉(zhuǎn)移到直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，-20 ℃靜置24 h。將培養(yǎng)皿浸入冰水浴中，每3 h替換水溶液直到無(wú)肉眼可見(jiàn)溶劑浸出，用以除去有機(jī)溶劑DMSO。將制備好的多孔PU薄膜放入37 ℃烘箱干燥24 h，備用[10]。

1.3 肝素的固定

將制備好的多孔PU薄膜裁剪成2 cm×2 cm正方形，在異丙醇溶液中超聲洗滌10 min，放入37 ℃烘箱干燥24 h。取出多孔PU薄膜，采用低溫氧等離子體(120 W,10 s)處理。將處理后的多孔PU薄膜浸入丙烯酸溶液中浸泡12 h。然后將丙烯酸接枝的多孔PU薄膜浸入含有EDC(10 g/L)的檸檬酸鹽緩沖溶液 (pH 5,20 mL) 中于4 ℃下靜置2 h。最終將樣品浸入含肝素(1.25 g/L)的檸檬酸鹽緩沖溶液中4 ℃下反應(yīng)24 h。取出PU薄膜，蒸餾水多次洗滌，室溫干燥[11]。

1.4 肝素修飾的多孔PU薄膜的形態(tài)與結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 表面結(jié)構(gòu)表征

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜可通過(guò)材料表面的反射信號(hào)獲取材料表層有機(jī)成分的結(jié)構(gòu)信息。檢測(cè)樣品包括：多孔PU薄膜、肝素修飾的多孔PU薄膜。

采用電子光譜儀對(duì)薄膜的化學(xué)成分進(jìn)行分析。

1.4.2 水接觸角測(cè)試

通過(guò)懸滴法測(cè)量薄膜的表面水接觸角，每個(gè)樣品所用水滴量為20 μL,平行實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組。

1.4.3 掃描電子顯微鏡(SEM)測(cè)試

將待測(cè)樣品表面噴金后，通過(guò)日本電子株式會(huì)社JMS-7600F型高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察樣品表面形貌。

1.4.4 力學(xué)性能測(cè)試

采用系列Ⅸ自動(dòng)化材料測(cè)試系統(tǒng)測(cè)量薄膜的楊氏模量和斷裂應(yīng)變，測(cè)試溫度22 ℃，濕度30%，速度50 mm/min。

1.5 肝素修飾的多孔PU薄膜的血液相容性表征

1.5.1 全血與血小板黏附測(cè)試

實(shí)驗(yàn)用血為新鮮新西蘭白兔全血，采用真空采血管耳靜脈取血。為模擬體內(nèi)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前將多孔PU薄膜浸泡于磷酸鹽緩沖(PBS)溶液中(pH=7.4)平衡24 h。吸出PBS溶液，加入新鮮的全血(富血小板血漿)，37 ℃下孵化1 h。吸出溶液，采用PBS溶液多次洗滌，加入2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的戊二醛固定液室溫固定30 min。再次采用PBS溶液洗滌，依次用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇-水溶液(50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水處理，每次間隔30 min，室溫晾干。將樣品表面噴金，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察樣品表面血細(xì)胞和血小板黏附情況[12]。

1.5.2 體外凝血時(shí)間測(cè)試

體外凝血時(shí)間測(cè)定包括：活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)和凝血酶時(shí)間(TT)[13]。具體操作步驟如下。

1)制備貧血小板血漿：真空采血管耳靜脈抽取的新鮮兔全血以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理15 min，取上層血漿即為貧血小板血漿。

2)將裁剪好的薄膜樣品置于離心管中，加入1 mL貧血小板血漿。

3)37 ℃下孵育1 h，加入對(duì)應(yīng)的APTT、PT和TT試劑。利用半自動(dòng)血凝分析儀通過(guò)比濁法，根據(jù)待測(cè)樣品在凝血過(guò)程中的吸光度變化來(lái)確定凝血時(shí)間。每個(gè)樣品平行測(cè)試3次，同時(shí)以空白血漿作為空白對(duì)照[14]。

1.5.3 溶血率測(cè)試

將新鮮抽取的抗凝全血于1 500 r/min離心10 min除去上清液，再加入PBS后1 500 r/min 離心10 min， 重復(fù)洗滌2～3次，直至上清液澄清。用PBS溶液將所得紅細(xì)胞配制成2%的紅細(xì)胞懸浮液。將裁剪好的薄膜樣品置于離心管中，加入1 mL PBS溶液，同時(shí)加入1 mL 2%的紅細(xì)胞懸浮液。37 ℃靜置孵化1.5 h。取出薄膜，將混合溶液于1 500 r/min離心10 min，取200 μL上層液體轉(zhuǎn)移到96孔板中，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取570 nm下的吸光值。每個(gè)樣品平行測(cè)試3次，同時(shí)設(shè)置PBS為陰性對(duì)照，蒸餾水為陽(yáng)性對(duì)照，溶血率計(jì)算見(jiàn)式(1)。

溶血率=(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)×100%

(1)

式中：ODt為樣品吸光度；ODnc為陰性對(duì)照吸光度； ODpc為陽(yáng)性對(duì)照吸光度[15]。

1.5.4 紅細(xì)胞形態(tài)觀察

將1.5.3節(jié)中樣品孵化后離心得到的紅細(xì)胞滴在玻璃載玻片上，采用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡觀察并記錄紅細(xì)胞形態(tài)[16]。

1.5.5 補(bǔ)體激活及血小板激活測(cè)試

將裁剪好的薄膜樣品與貧血小板血漿在37 ℃下孵育1 h。然后采用商用試劑盒C3a Elisa kit (BD OptEIATM)，通過(guò)測(cè)定活性片段C3a和C3a的脫-精氨酸的形成，來(lái)分析補(bǔ)體激活情況。

將裁剪好的薄膜樣品與貧血小板血漿在37 ℃下孵育1 h。使用流式細(xì)胞儀來(lái)評(píng)估血小板的活化狀態(tài)。通過(guò)測(cè)定熒光標(biāo)記的血小板活化標(biāo)記物——抗CD62P和血小板標(biāo)記物——抗-CD42a的表達(dá)來(lái)衡量血小板激活的比例。

1.6 裝載VEGF并測(cè)試其細(xì)胞活力和增殖

將肝素修飾后的多孔PU薄膜浸泡于VEGF溶液中(50 ng/mL)，一定時(shí)間(2 h/24 h)后取出樣品，用PBS溶液洗滌后用于細(xì)胞培養(yǎng)。為了評(píng)估PU-heparin-VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞活力的影響，將樣品置于24孔板上，在每孔中加入5×105個(gè)細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC。為了評(píng)估PU-heparin-VEGF對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響，預(yù)先對(duì)HUVEC進(jìn)行饑餓處理(只添加20 g/L牛血清)12 h，然后將細(xì)胞接種于多孔PU薄膜上，接種密度為5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)96 h。培養(yǎng)過(guò)后，通過(guò)測(cè)定酸性磷酸酶的活性來(lái)反映細(xì)胞活力和增殖情況。具體方法如下：細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)后的樣品采用PBS溶液(1 mL)洗滌，之后置于培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)，在緩沖溶液中(含0.1 mol/L，pH5.5乙酸鈉和0.1%曲拉通X-100)與對(duì)硝基苯磷酸(1 mg/mL)共孵化3 h。添加NaOH(1 mol/L)溶液終止反應(yīng)，通過(guò)測(cè)量405 nm下的光密度(OD405)來(lái)計(jì)算活細(xì)胞的數(shù)量[17]。

圖2 多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的光電子能譜圖 Fig.2 ESCA of porous PU and PU-heparin film

2 結(jié)果與討論

2.1 多孔PU薄膜的表面光譜分析

圖1 多孔PU薄膜的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectrum of porous polyurethane film

圖2為多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的光電子能譜圖。由圖2可知：多孔PU薄膜上主要的峰分別位于540～525 、408～396 、294～278 和174～162 eV，依次對(duì)應(yīng)于O-1s、N-1s、C-1s和S-2p的峰。比較肝素修飾前后的多孔PU薄膜的峰值，O-1s、N-1s和C-1s的峰值沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化，而修飾過(guò)后S-2p的峰值明顯增強(qiáng)，對(duì)應(yīng)于肝素中磺酸根的峰(表1)。由此可以證明肝素修飾多孔PU薄膜成功。

表1 多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的光電子能譜圖

2.2 多孔PU薄膜的水接觸角測(cè)試

通過(guò)水接觸角測(cè)試考察多孔PU薄膜的親水性，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：與未經(jīng)修飾的多孔PU薄膜相比(142.82°)，修飾過(guò)后薄膜的水觸角明顯減小(38.72°)，這是由于肝素中含有大量的羧基、羥基以及醚鍵等親水性基團(tuán)，使材料表面的親水性增強(qiáng)，以此可以說(shuō)明肝素被成功修飾至PU薄膜上。

2.3 多孔PU薄膜的表面形貌表征

圖4為掃描電子顯微鏡觀察到的多孔PU薄膜的表面形貌。由圖4可知：由于在冷卻過(guò)程中聚合物溶液經(jīng)歷了液相分離過(guò)程，因此，薄膜由許多大小不均一的致密孔結(jié)構(gòu)組成，孔徑范圍為0.1～200 μm。此外，由于在接枝肝素的過(guò)程中使用了氧氣等離子處理，所以多孔PU-heparin膜樣品表面多孔結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，但貫通的孔結(jié)構(gòu)依然存在，只是孔數(shù)量有一定減少，尤其是小孔的數(shù)量。多孔結(jié)構(gòu)的保留為材料提供了較大的內(nèi)表面積，為后期細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)提供了保障。

圖3 多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的水接觸角圖片F(xiàn)ig.3 Water contact angle pictures of porous PU and PU-heparin film

圖4 PU和PU-hep薄膜的掃描電子顯微鏡結(jié)果Fig.4 SEM images of porous PU and PU-heparin films

2.4 多孔PU薄膜的力學(xué)性能測(cè)試

表2顯示了多孔PU薄膜的力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果。由表2可知：多孔PU薄膜的斷裂伸長(zhǎng)率為446%，楊氏模量為1.295；多孔PU-heparin薄膜的斷裂伸長(zhǎng)率為162%，楊氏模量為2.297。由于接枝肝素的過(guò)程中使用了等離子體處理，所以對(duì)膜的力學(xué)性能有一定損傷，多孔PU-heparin 薄膜的模量增大，斷裂伸長(zhǎng)率明顯降低，多孔PU-heparin 薄膜的力學(xué)性能依然可以達(dá)到組織工程材料的要求[19]。

表2 多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的斷裂伸長(zhǎng)率和楊氏模量

2.5 多孔PU薄膜的血液相容性評(píng)價(jià)

2.5.1 全血與血小板黏附情況分析

圖5為多孔PU薄膜的血液相容性評(píng)價(jià)結(jié)果。由圖5可知：在多孔PU薄膜上可以看到明顯的紅細(xì)胞和血小板黏附情況，大部分的血小板形貌破壞出現(xiàn)偽足；而多孔PU-heparin 薄膜的表面幾乎未見(jiàn)黏附的紅細(xì)胞和血小板。這表明了修飾肝素可以賦予多孔PU-heparin 薄膜優(yōu)異的抗黏附特性。這是由于改性的肝素層中帶有一定的負(fù)電荷，而紅細(xì)胞膜本身也帶有負(fù)電荷，通過(guò)靜電排斥作用抑制了紅細(xì)胞的黏附。

圖5 血細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of blood-cell adhesion

2.5.2 體外凝血時(shí)間分析

體外凝血時(shí)間APTT、PT和TT常在臨床上被用于判斷血漿的異常情況。同時(shí)，它也可以被用于判斷生物材料的體外抗凝血性能。分別對(duì)空白組、多孔PU薄膜和多孔PU-heparin 薄膜的體外凝血時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，肝素的修飾可以有效延長(zhǎng)薄膜的體外凝血時(shí)間，賦予材料良好的抗凝血性能[20]。

圖6 多孔PU薄膜和多孔PU-heparin薄膜的 APTT/PT/TT體外凝血時(shí)間Fig.6 APTT/PT/TT of porous PU and PU-heparin films

2.5.3 溶血率分析

溶血率也是判斷生物材料血液相容性的重要指標(biāo)，生物材料必須滿足溶血率<5%。圖7為多孔PU薄膜和多孔PU-heparin薄膜的溶血率結(jié)果。由圖7可知：多孔PU薄膜和多孔PU-heparin 薄膜溶血率均遠(yuǎn)小于規(guī)定值，因此可以判斷薄膜具有良好的血液相容性能。

圖7 多孔PU薄膜和多孔PU-heparin薄膜的溶血率Fig.7 Hemolysis of porous PU and PU-heparin memberances

2.5.4 紅細(xì)胞形態(tài)分析

紅細(xì)胞形態(tài)可以直觀地反映材料的安全性能。圖8為與多孔PU薄膜和多孔PU-heparin薄膜共孵化后的紅細(xì)胞形態(tài)在光學(xué)顯微鏡下的照片。由圖8可知，在PBS溶液中未經(jīng)處理的紅細(xì)胞顯示出正常的凹餅狀結(jié)構(gòu)，而與多孔PU薄膜和多孔PU-heparin 薄膜孵化后，紅細(xì)胞未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)異?，F(xiàn)象和凝集現(xiàn)象，與溶血率結(jié)果保持一致。

圖8 光學(xué)顯微鏡下的紅細(xì)胞形態(tài)照片F(xiàn)ig.8 Optical images of RBCs

2.5.5 補(bǔ)體激活和血小板激活情況分析

通過(guò)補(bǔ)體激活和血小板激活測(cè)試，可以從分子水平判斷材料的血液相容性。在補(bǔ)體激活過(guò)程中，C3a是一個(gè)重要的標(biāo)志物，它在血漿中的濃度可以直接反映補(bǔ)體激活程度。圖9為多孔PU和PU-肝素薄膜的補(bǔ)體激活和血小板激活結(jié)果。由圖9(a)可知，多孔PU-heparin 薄膜不會(huì)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，將來(lái)這種材料植入體內(nèi)由于不會(huì)激活補(bǔ)體系統(tǒng)所以不會(huì)進(jìn)一步引發(fā)免疫系統(tǒng)的激活。

血小板激活能夠在體內(nèi)引起血栓的形成，所以血小板激活實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)與血液接觸材料的一個(gè)必要實(shí)驗(yàn)。如圖9(b)所示：相比于陰性對(duì)照組，多孔PU-heparin 薄膜組血小板激活率無(wú)明顯差異，說(shuō)明多孔PU-heparin 薄膜展示了良好的生物相容性，避免了在今后的植入應(yīng)用中可能會(huì)引起的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)及進(jìn)而引發(fā)的血栓現(xiàn)象。

圖9 與多孔PU和PU-肝素薄膜共孵化后的補(bǔ)體激活(a)和血小板激活情況(b)Fig.9 Complement activation (a) and platelet activation (b) upon interaction of porous PU and PU-heparin films

2.6 細(xì)胞活力評(píng)價(jià)

圖10為多孔PU薄膜材料的細(xì)胞活力評(píng)價(jià)結(jié)果。由圖10可見(jiàn):加入VEGF培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組吸光值均高于未加入VEGF的實(shí)驗(yàn)組吸光值，原因在于VEGF對(duì)HUVECs的生長(zhǎng)有很好的促進(jìn)作用，而且接枝肝素的聚氨酯多孔材料由于對(duì)VEGF有更高的裝載量，同時(shí)對(duì)VEGF有著緩釋作用，這些原因?qū)е铝硕嗫譖U-heparin-VEGF薄膜比多孔PU -VEGF薄膜有更高的吸光值。從裝載VEGF的時(shí)間上來(lái)看，裝載24 h的吸光值也高于裝載2 h的吸光值，說(shuō)明裝載時(shí)間也會(huì)對(duì)裝載量造成影響。

圖10 細(xì)胞活力評(píng)價(jià)Fig.10 Cell viability evaluation

3 結(jié)論

采用熱致相分離法制備了多孔PU薄膜，采用肝素進(jìn)行多孔PU薄膜的功能化改性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與改性前相比，修飾肝素可以賦予多孔PU薄膜優(yōu)異的抗黏附特性，有效延長(zhǎng)薄膜的體外凝血時(shí)間，降低溶血率，避免紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)異?，F(xiàn)象和凝集現(xiàn)象，同時(shí)避免補(bǔ)體激活和血小板激活現(xiàn)象。因此，肝素修飾的多孔PU薄膜展示了良好的生物相容性。此外，進(jìn)一步采用VEGF對(duì)薄膜進(jìn)行修飾，可以有效提高生物活性涂層的細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，為多孔聚氨酯組織工程材料在新生血管方向的應(yīng)用提供了新的思路。