彭 鋼，俞亞東，陳曉君，黃 和

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇南京211800；2.江蘇先進生物與化學制造協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210009；3.南京工業(yè)大學 化學與分子工程學院，江蘇南京211800；4.南京工業(yè)大學 藥學院，江蘇南京211800)

隨著中國經(jīng)濟的增長和人民生活水平的不斷提高，健康問題和食品安全成為人們關(guān)注的焦點，人類的各種疾病基本都是遺傳因素與環(huán)境因素共同導致的[1]；同時，轉(zhuǎn)基因食品的安全性和食品摻假是食品安全中被普遍關(guān)注的問題[2]。鑒于此，發(fā)展基因檢測技術(shù)對基因疾病診斷、疾病預防性基因體檢和食品安全檢測尤為重要。目前基因檢測常用方法有熒光定量聚合酶鏈式反應[3]、基因芯片[4]、液態(tài)生物芯片[5]、微流控技術(shù)[6]、Northern和Western印跡[7]等技術(shù)。盡管這些方法具有靈敏度高、準確性強等優(yōu)點，但對儀器的要求較高，而且需要對樣品進行繁瑣的前處理，成本高、耗時長，不適于大量樣品的現(xiàn)場快速檢測。與其他方法相比，電化學傳感器具有制備簡單、成本低、耗時短等優(yōu)點，成為基因檢測的研究熱點。但是，開發(fā)性能優(yōu)異的電化學傳感器需要做到以下兩點：①傳感器界面的構(gòu)建；②電信號的放大。然而傳感器界面的構(gòu)建和電信號的放大離不開優(yōu)異性能的材料。

納米材料具有獨特的優(yōu)勢，如體積效應、表面效應、量子尺寸效應、介電限域效應和量子隧道效應，使其在電化學傳感器領(lǐng)域得到廣泛應用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，納米尺度下的新型二維材料，如石墨烯及其復合材料等，具有優(yōu)異的物理化學性能，為探索開發(fā)快速、靈敏、低成本、穩(wěn)定的基因檢測新方法帶來了希望[8-11]。本文中，筆者就近年來基于石墨烯復合材料的電化學傳感器在基因檢測領(lǐng)域的研究進行綜述。

1 石墨烯特性

石墨烯是由純碳原子六元環(huán)平面結(jié)構(gòu)構(gòu)成的、只有一層原子厚度的二維晶體[12]。它可以翹曲成零維的富勒烯，卷成一維的碳納米管或者堆垛成三維的石墨[13](圖1)。2004年，英國曼徹斯特大學物理學家安德烈·蓋姆和康斯坦丁·諾沃肖洛夫，首次利用機械剝離的方法成功從石墨中分離出石墨烯，證實它可以單獨存在，推動了科學家們對二維納米材料的研究熱情[14]。石墨烯具有非常大的理論比表面積、很高的力學強度[15]、超高的光學透過率、優(yōu)良的導熱性[16]、高導電性和熒光猝滅特性等。石墨烯更為奇特之處是它具有獨特的電子結(jié)構(gòu)和電學性質(zhì)，能隙為0，而且石墨烯中電子的運動速度達到光速的1/300[17]。石墨烯具有的奇特性質(zhì)，使得其能夠滿足高靈敏性傳感器設計的需求，為發(fā)展基因檢測技術(shù)帶來希望。

圖1 石墨烯翹曲成零維富勒烯，卷成一維碳納米管 或者堆垛成三維的石墨[13]Fig.1 Graphene can be wrapped up into 0D fullerenes, rolled into 1D nanotubes or stacked into 3D graphite[13]

2 石墨烯的制備方法

由于單層或多層石墨烯材料廣泛應用于各個領(lǐng)域，而且自然界中石墨烯以堆疊成石墨形式存在，促成制備高質(zhì)量、大面積、尺寸可控、層數(shù)可控的石墨烯方法不斷發(fā)展。目前，石墨烯的制備方法可分為物理方法和化學方法。物理方法包括機械剝離法[18-19]、液相直接剝離法[20-22]等；化學方法包括氧化石墨還原法[23-27]、化學氣相沉積法(CVD)[28-32]等，表1總結(jié)了幾種常用的石墨烯制備方法。

表1 石墨烯制備的常用方法

然而，上述方法制備石墨烯，存在著不能同時滿足制備出尺寸大、質(zhì)量好、精確控制納米片的層數(shù)、容易轉(zhuǎn)移到其他基體、成本低等需求的問題(表2)。因而，石墨烯的制備仍將是今后研究的重點。

表2 幾種常見的石墨烯制備方法優(yōu)缺點比較

3 石墨烯復合材料電化學傳感器在基因檢測中的應用

石墨烯獨特的結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的性能引起了研究者極大的興趣，但單一的石墨烯材料往往因為團聚，難以發(fā)揮其優(yōu)異的性能，最近研究發(fā)現(xiàn)石墨烯復合材料可以有效地抑制石墨烯的不可逆團聚，充分發(fā)揮石墨烯以及石墨烯復合材料的優(yōu)異性能[33]?；谑┑膹秃喜牧鲜鞘妙I(lǐng)域中的重要研究方向之一，在能量儲存[34]、液晶器件[35]、生物成像[36]和傳感器件[37]等領(lǐng)域展現(xiàn)出了優(yōu)良性能，具有廣闊的應用前景。根據(jù)組分不同，石墨烯復合材料可分為石墨烯/無機復合材料、石墨烯/有機復合材料、石墨烯/有機/無機復合材料和其他石墨烯復合材料，將進行詳細討論。

3.1 石墨烯/無機復合材料

石墨烯/無機物納米復合材料是通過一步法或多步法合成的。Chen等[38]通過一步水熱法合成了氮摻雜石墨烯/Fe3O4粒子復合材料，并構(gòu)建了電化學傳感器應用于DNA的檢測。Hajihosseini等[39]通過兩步法將石墨烯/納米金復合材料修飾在電極表面構(gòu)成一個傳感器，并應用于DNA的檢測。在復合材料中，無機納米粒子可以增加石墨烯的片層間距，阻礙石墨烯的不可逆團聚，保留單層石墨烯的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；而且，無機納米粒子和石墨烯之間的協(xié)同效應使得復合材料擁有了更加優(yōu)異的性能。

Chen等[40]利用氧化石墨烯、氨水和水合肼一步水熱合成了氮摻雜石墨烯，乙二醇作為還原劑制備了氮摻雜石墨烯/納米金復合物，構(gòu)建了一種基于氮摻雜石墨烯/納米金復合物的電化學生物傳感器(圖2)，在最優(yōu)條件下，采用差分脈沖伏安法檢測人類多藥耐藥基因的線性范圍為1.0×10-14～1.0×10-7mol/L，檢出限為3.12×10-15mol/L。Wang等[41]采用電化學沉積法制備了石墨烯/納米金修飾玻碳電極，在最優(yōu)條件下，對目標DNA的檢測范圍為1.0×10-16～1.0×10-7mol/L，檢測限為3.5×10-17mol/L。Jafari等[42]制備了氧化鈰納米粒子/石墨烯復合物，將其修飾到玻碳電極表面，構(gòu)建DNA傳感器，對DNA的線性響應范圍為1.0×10-15～1.0×10-8mol/L，檢出限為1.0×10-16mol/L。Teymourian等[10]制備了Fe3O4納米粒子/石墨烯復合材料應用于DNA檢測，線性響應范圍為1.0×10-17～1.0×10-10mol/L。Shuai等[43]制備出MgO納米粒子/納米金/石墨烯復合材料，構(gòu)建了RNA電化學傳感器，獲得的線性響應范圍為1.0×10-16～1.0×10-13mol/L，檢出限為5.0×10-17mol/L。可見，石墨烯/無機復合材料被應用到基因檢測領(lǐng)域并得到快速發(fā)展。筆者總結(jié)了近幾年石墨烯/無機復合材料在基因檢測方面的研究應用，匯總于表3。

圖2 電化學DNA傳感器構(gòu)建流程[40]Fig.2 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[40]

復合材料檢測對象線性范圍/(mol·L-1)檢出限/(mol·L-1)文獻石墨烯/氧化鎳DNA1.0×10-13～1.0×10-63.12×10-14[44]石墨烯/氧化鋯DNA1.0×10-13～1.0×10-63.23×10-14[45]石墨烯/納米銀DNA1.0×10-14～1.0×10-87.6×10-15[46]石墨烯/納米金DNA5.0×10-16～5.0×10-113.6×10-16[47]石墨烯/氧化釔DNA1.0×10-17～1.0×10-95.95×10-18[48]石墨烯/納米金/氧化鎂RNA1.0×10-16～1.0×10-135.0×10-17[43]石墨烯/二硫化鎢DNA1.0×10-14～5.0×10-102.3×10-15[49]

3.2 石墨烯/有機復合材料

石墨烯中的π-π共軛結(jié)構(gòu)能夠通過π-π堆積作用被有機物功能化，同時，石墨烯被羧基化或羥基化后也能夠通過共價鍵連接有機物，形成石墨烯/有機復合材料。Zainudin等[11]利用π-π堆積作用制備了1-吡啶酸/石墨烯復合材料，構(gòu)建了阻抗型電化學傳感器應用于檢測大腸桿菌DNA，線性檢測范圍為1.0×10-14～1.0×10-10mol/L，檢出限為7.0×10-16mol/L。Zhang等[50]依據(jù)π-π堆積作用合成了色胺/石墨烯復合材料，然后修飾到玻碳電極表面，構(gòu)成無標記的DNA電化學傳感器(圖3)，通過阻抗分析獲得線性檢測范圍為1.0×10-12～1.0×10-7mol/L，檢出限為5.2×10-13mol/L。Li等[51]利用全氟磺酸/石墨烯修飾絲網(wǎng)印刷碳電極，以胭脂紅酸為信號探針，構(gòu)建了DNA電化學傳感器用于目標HIV-1序列的檢測。在最優(yōu)條件下，獲得的線性檢測范圍為4.0×10-8～2.56×10-6mol/L，檢出限為5.0×10-9mol/L。Tran等[52]制備了碳納米管/石墨烯復合物，將其修飾到絲網(wǎng)印刷金電極表

面，并利用辣根過氧化物酶催化系統(tǒng)進行信號放大，構(gòu)建了RNA傳感器，線性范圍1.0×10-14～1.0×10-10mol/L。由于有機物種類多，因此，石墨烯/有機復合材料電化學傳感器在基因檢測中的應用潛力巨大。筆者總結(jié)了近幾年石墨烯/有機復合材料在基因檢測方面的研究應用，匯總于表4。

圖3 電化學DNA傳感器構(gòu)建流程[50]Fig.3 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[50]

表4 基于石墨烯/有機復合材料電化學傳感器在基因檢測中的應用實例

3.3 石墨烯/有機/無機復合材料

為了充分發(fā)揮各種材料的性能以及完善石墨烯納米復合材料的不足，研究人員進一步合成了石墨烯/有機/無機復合材料。有機物富含芳香基團和各種官能團，易于與石墨烯結(jié)合，同時還可以用作石墨烯與無機物結(jié)合的橋梁，例如，Yola等[56]首先利用巰基乙胺使石墨烯富含巰基，再通過金-巰鍵結(jié)合金鐵納米復合物合成了石墨烯/有機物/無機物復合材料，并用堿性藍41作為信號分子，構(gòu)建了高靈敏的DNA電化學傳感器應用于DNA檢測，獲得了較好的線性范圍1.0×10-14～1.0×10-8mol/L，檢出限為2.0×10-15mol/L。Shi等[9]首先通過滴涂將石墨烯固定在電極表面，然后通過π-π堆積作用將帶負電的聚苯乙烯磺酸固定在電極表面，最后通過靜電作用將帶正電的金納米棒固定在電極表面，以阿霉素為信號分子，構(gòu)建DNA電化學傳感器用于目標DNA檢測(圖4)，通過差分脈沖伏安法分析獲得線性檢測范圍為1.0×10-16～1.0×10-9mol/L，檢出限為3.5×10-17mol/L。Huang等[57]首先將石墨烯與納米金修飾在玻碳電極表面，然后通過循環(huán)伏安法將硫堇沉積在電極表面形成石墨烯/納米金/硫堇復合物，以1,10-鄰菲咯啉二氯合釕為信號分子，構(gòu)建DNA電化學傳感器用于人乳頭瘤病毒DNA檢測，獲得線性檢測范圍為1.0×10-13～1.0×10-10mol/L，檢出限為4.03×10-14mol/L。Liu等[58]合成了聚酰胺-胺型樹狀大分子/銀金納米簇復合物，通過酰胺鍵與修飾在電極表面的石墨烯結(jié)合，形成石墨烯/聚酰胺-胺型樹狀大分子/銀金納米簇復合物，并利用辣根過氧化物酶催化作用對信號進行放大，構(gòu)建RNA電化學傳感器應用于microRNA-126檢測，線性響應范圍為1.0×10-15～1.0×10-8mol/L，檢出限為7.9×10-16mol/L。不難看出，石墨烯/有機/無機復合物材料充分發(fā)揮了各自的特性，具有協(xié)同效應，這將為發(fā)展更優(yōu)異的電化學基因檢測傳感器帶來希望。筆者總結(jié)了近幾年石墨烯/有機/無機復合材料在基因檢測方面的研究應用，匯總于表5。

圖4 電化學DNA傳感器構(gòu)建流程[9]Fig.4 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[9]

復合材料檢測對象線性范圍/(mol·L-1)檢出限/(mol·L-1)文獻石墨烯/巰基乙胺/納米金鐵DNA1.0×10-14～1.0×10-82.0×10-15[56]石墨烯/殼聚糖/二硫化釩DNA5.0×10-13～5.0×10-105.2×10-14[59]石墨烯/聚苯乙烯磺酸/金納米棒DNA1.0×10-16～1.0×10-93.5×10-17[9]石墨烯/納米金/聚硫堇DNA1.0×10-13～1.0×10-104.03×10-14[57]石墨烯/氧化鐵/聚黃尿酸DNA1.0×10-16～1.0×10-93.2×10-17[60]石墨烯/聚苯胺/納米金DNA1.0×10-11～2.0×10-81.05×10-12[61]石墨烯/聚酰胺胺/銀金納米RNA1.0×10-15～1.0×10-87.9×10-16[58]石墨烯/鐵酸鎳/殼聚糖DNA1.0×10-16～1.0×10-61.0×10-16[62]石墨烯/碳納米管/納米金DNA1.0×10-16～5.0×10-103.3×10-17[63]石墨烯/殼聚糖/聚苯胺/納米金DNA1.0×10-11～5.0×10-92.11×10-12[64]石墨烯/氧化鋅/1芘丁酸琥珀酰亞胺酯RNA1.0×10-11～1.0×10-64.3×10-12[65]

3.4 其他石墨烯復合材料

石墨烯還可以與其他材料如血紅素、酶和DNA形成復合材料，賦予復合材料更好的生物相容性。Ye等[66]利用血紅素將石墨烯功能化固定在電極表面，然后通過電沉積將納米金固定在電極表面，構(gòu)成DNA電化學傳感器用于DNA檢測，獲得的線性檢測范圍為1.0×10-18～1.0×10-13mol/L，檢出限為1.4×10-19mol/L。Hu等[67]利用石墨烯量子點作為載體固定辣根過氧化物酶進行信號放大，構(gòu)建RNA電化學傳感器，檢測miRNA-155時獲得的線性范圍為1.0×10-15～1.0×10-10mol/L，檢出限為1.4×10-16mol/L。更多的石墨烯復合材料有待研究者進一步研究和開發(fā)，使其在電化學基因檢測中的應用越來越多。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，石墨烯復合材料在電化學基因傳感的應用中展現(xiàn)出了優(yōu)越的性能，主要歸因于：1)石墨烯具有大的比表面積、高的導電性和良好的生物相容性；2)石墨烯復合材料中各組分之間相互的協(xié)同效應。同時，筆者也發(fā)現(xiàn)研究中存在的一些不足：1)石墨烯尺寸的不均勻性影響了傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；2)石墨烯復合材料的結(jié)構(gòu)缺陷明顯地影響了其電子傳遞性能，而且復合材料中各組分比例不同也會影響復合材料的綜合性能。

為了使石墨烯復合材料在基因檢測分析中有更好的應用前景，筆者提出兩點建議：1)研發(fā)更加溫和地制備均勻石墨烯的方法；2)制備石墨烯復合材料時，深入研究各組分比例對復合材料性質(zhì)及傳感性能的影響。相信隨著科學家們不斷的研究和新技術(shù)的成熟，基于石墨烯復合材料電化學傳感器在實際基因檢測中將有廣闊的應用前景。