劉同慎 李 冰 羅慧瓊 駱倩倩 龐 敏
(濱州醫(yī)學院實驗教學管理中心形態(tài)學實驗室, 煙臺 264003)
尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一,為神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和功能蛋白質(zhì)的合成部位,其數(shù)量和分布與神經(jīng)元的功能狀態(tài)密切相關(guān),在形態(tài)學研究中常常需要特殊染色進行顯示。本文對應(yīng)用甲苯胺藍顯示貓神經(jīng)元尼氏體的組織塊染色技術(shù)進行了探索,并獲得了較為滿意的效果,特報道如下。
1.1 甲苯胺藍染色液的配制
甲苯胺藍1g,蒸餾水100ml,磁力攪拌器攪拌至少12h。染色前配制,過濾后使用。
1.2 動物
健康成年貓4只,雌雄不限,每只體質(zhì)量約1.5kg。
1.3 取材和固定
腹腔內(nèi)注射1%的水合氯醛水溶液對動物深度麻醉(150mg/kg)。取出脊髓,留取頸膨大和腰膨大部位,垂直橫切成段,每段長約0.5cm,共24塊。立刻將組織塊投入10%甲醛固定液固定24h。
1.3 組織塊染色
組織塊經(jīng)蒸餾水充分洗滌后,將其分為4組,每組6塊。分別入甲苯胺藍染色液,37℃染色。I~IV組分別染色2、4、8d和16d。
1.4 組織塊石蠟包埋
Ⅰ~Ⅳ組組織塊染色時間完成后,分別按照下列相同程序進行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋: 50%乙醇脫水1h;75%乙醇脫水1h;95%乙醇Ⅰ脫水2h;95%乙醇Ⅱ脫水2h;100%乙醇Ⅰ脫水2h;100%乙醇Ⅱ脫水2h;二甲苯Ⅰ透明1.5h;二甲苯Ⅱ透明1.5h;石蠟Ⅰ浸蠟1h;石蠟Ⅱ浸蠟2h;石蠟Ⅲ浸蠟2h;包埋蠟(含有1%的蜂蠟)包埋。
1.5 切片、裱片和封片
旋轉(zhuǎn)切片機切片,厚5μm。載玻片裱片,恒溫干燥箱烘干,二甲苯脫蠟,中性樹膠封固。
1.6 觀察
應(yīng)用普通光學顯微鏡,高倍鏡下觀察比較各組的染色情況,并拍照記錄。
高倍鏡下顯示,Ⅰ組和Ⅱ組切片標本上的神經(jīng)元胞體和樹突呈現(xiàn)較為均勻的藍色,尼氏體不清晰,核仁藍色,背景無色(圖1A、1B);Ⅲ組和Ⅳ組,尼氏體位于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi),顆粒狀或者斑塊狀,呈藍色,清晰可辨,核仁藍色,背景無色(圖1C、1D)。
圖1 甲苯胺藍組織塊染色的神經(jīng)元和尼氏體,×400A: 染色2d;B: 染色4d;C: 染色8d;D: 染色16d
在與神經(jīng)科學相關(guān)的形態(tài)學研究中,神經(jīng)元是觀察的重點內(nèi)容之一,而由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體組成的尼氏體位于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi),是神經(jīng)元的重要特征性結(jié)構(gòu)之一,與神經(jīng)元的功能狀態(tài)密切相關(guān)。神經(jīng)元在正常狀態(tài)下,尼氏體一般都有比較固定的形態(tài)[1]。而當神經(jīng)元受到損傷時,尼氏體的變化最為敏感,主要表現(xiàn)為尼氏體的溶解和消失。在常規(guī)HE染色切片標本上,尼氏體的形態(tài)變化并不是很明顯[2],當需要判斷神經(jīng)元的損傷程度或者判別顯示的細胞是否是神經(jīng)元的時候,往往需要尋求做尼氏體染色[3]。尼氏體的主要化學成分是核糖核酸和蛋白質(zhì),有核外染色質(zhì)之稱[3],與堿性染料如甲苯胺藍、硫堇等具有親和力,其中甲苯胺藍染色是最為常用的顯示尼氏體的傳統(tǒng)方法。但是,甲苯胺藍在顯示尼氏體和核仁為藍色的同時,背景也呈現(xiàn)淺藍色,致使尼氏體的清晰度和分辨效果較差[4],極大地影響對于實驗結(jié)果的形態(tài)學觀察、判斷和分析。
從現(xiàn)有的文獻資料分析發(fā)現(xiàn),特染尼氏體大都是采用片染技術(shù),即先進行組織切片,再進行染色[2,4]。而將組織制作成組織切片,是一個耗時的繁瑣過程,要經(jīng)過組織處理、切片、裱片、烤片、切片的脫蠟和水化等多個程序。在此過程中,組織需要經(jīng)過脫水劑、透明劑等化學試劑處理,并經(jīng)受浸蠟和烤片的高溫。這些化學試劑和高溫,對于尼氏體的嗜色性及其與染料的親和力都可能存在較大影響,致使片染時出現(xiàn)尼氏體不著色或者著色淺、背景有不應(yīng)有的著色等現(xiàn)象。組織塊染色是將經(jīng)過固定的組織先進行染色后,再進行組織處理和石蠟包埋切片程序[5]。故塊染技術(shù)避免了化學試劑和高溫對于尼氏體嗜色性的影響,染色結(jié)果較為真實地反映出組織結(jié)構(gòu)成分特有的嗜色特性。本文采用的甲苯胺藍對脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元的尼氏體進行組織塊染色技術(shù),國內(nèi)外文獻未見有報道。實驗結(jié)果顯示,塊染2~4d能夠顯示神經(jīng)元的全貌,但尼氏體結(jié)構(gòu)和分布不夠清晰。隨著染色時間的延長,至塊染8d,脊髓神經(jīng)元尼氏體可以清晰分辨,呈顆粒狀或者斑塊狀,分布于神經(jīng)元的胞體和樹突內(nèi),軸突內(nèi)未見,背景基本無色。所以,8d可做為脊髓神經(jīng)元尼氏體塊染的最佳時間。在相同條件下,我們進一步將此最佳時間成倍增加(16d),染色結(jié)果與最佳染色時間并無差異,說明尼氏體在達到與染料最大結(jié)合后,加長染色時間并沒有出現(xiàn)過度著色現(xiàn)象。
甲苯胺藍組織塊染色顯示脊髓神經(jīng)元的尼氏體,特異性強,無沉淀,無背景著色,結(jié)果穩(wěn)定,實驗方法具有可操作性和重復(fù)性。在組織學實驗教學以及與神經(jīng)科學相關(guān)的形態(tài)學研究中,應(yīng)用甲苯胺藍進行脊髓組織塊染顯示尼氏體,具有一定的推廣和應(yīng)用價值。