呂建國 孫燕玲

(湖北科技學(xué)院, 1 臨床醫(yī)學(xué)院&附屬第二醫(yī)院, 2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 咸寧 437100)

腦血管疾病與心臟病、惡性腫瘤并稱為當(dāng)今世界三大致死性疾病[1],其中缺血性腦血管疾病的發(fā)病率最高,約占全部腦血管患者的70%[2]。缺血腦組織盡早恢復(fù)或再通血液灌注,重新獲得血氧供應(yīng)是臨床上首要的治療原則。但閉塞的腦血管再通的同時(shí),會(huì)發(fā)生腦缺血再灌注損傷[3]。腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡主要有壞死和凋亡2種方式,細(xì)胞凋亡是重要的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式[4-5]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)級聯(lián)反應(yīng)事件的結(jié)果,在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中,caspase-3處于該級聯(lián)反應(yīng)的下游,它通過降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物使細(xì)胞死亡,與其他下游的caspase成員一起執(zhí)行凋亡事件[6]。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白,可通過抑制caspase-3的生成和活化,發(fā)揮抑制凋亡的作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用Pulsinelli 4血管閉塞法制備大鼠彌漫性全腦缺血模型,觀察Bcl-2和caspase-3在腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用以及銀杏葉提取物(extract of Ginkgo biloba, EGb761)對其的影響,探討EGb761對腦缺血遲發(fā)性損傷保護(hù)的分子機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供更充分的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

RM2245德國Leica石蠟切片機(jī)；CH2日本Olympus生物顯微鏡；BAS124S德國Sartorius電子天平；3K15德國Sigma高速冷凍離心機(jī)；PowerPac Basic美國Bio-Rad Western blotting電泳儀；Epoch美國BioTek酶標(biāo)儀；CFX Connect美國Bio-Rad熒光定量PCR儀；MDF-U53V日本Sanyo -80℃超低溫冰箱。

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)、 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；地高辛標(biāo)記脫核苷酸(DIG-dUTP) 購自德國B.M公司；生物素化抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin Body) 購自美國Sigma公司；TRIzol Reagent Kit購自美國Invitrogen公司；qPCR Kit購自日本Toyobo公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；抗Bcl-2抗體、抗Caspase-3抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國EarthOx公司；DAB顯色試劑盒及蛋白酶K由北京中山生物技術(shù)有限公司提供；EGb761由法國益普生藥業(yè)公司生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物模型及動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠42只,體質(zhì)量200～250g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供。將SD大鼠用水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉后,將大鼠頭部固定在顱腦定位儀上,剪毛后用75%乙醇消毒皮膚,經(jīng)枕部正中切口,分離暴露第1頸椎兩側(cè)的橫突翼小孔,電凝阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈。然后將大鼠仰臥位固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,在頸正中切口分離暴露雙側(cè)的頸總動(dòng)脈,勿傷及迷走神經(jīng)。在頸總動(dòng)脈下放置絲線,并打一活結(jié)松松地套在頸總動(dòng)脈上,外置備用。24h后,用外置絲線將事先已分離的頸總動(dòng)脈提起,用無損動(dòng)脈夾迅速夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,造成全腦缺血[9]。20min后,松開雙側(cè)頸動(dòng)脈夾進(jìn)行再灌注。局部噴灑慶大霉素注射液,再灌注時(shí)間為48 h。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)是： 全腦缺血開始約1 min內(nèi),動(dòng)物角膜反射消失,翻正反射消失,呼吸頻率加快,眼球變白,缺血期間無抽搐,肛溫在36.5℃～37.5℃。

將SD大鼠隨機(jī)分為3組,每組14只。(1) 假手術(shù)組(Sham組),除不阻斷頸總動(dòng)脈外,余手術(shù)操作同動(dòng)物模型制備。(2) 缺血再灌注組(IR組)，術(shù)前用生理鹽水按1ml/100g灌胃預(yù)處理,連續(xù)7d,每天1次。手術(shù)操作為動(dòng)物模型制備。(3) EGb761預(yù)處理組(EGb組),將EGb761用蒸餾水配制成濃度為10mg/ml,然后按1ml/100g對大鼠進(jìn)行術(shù)前預(yù)處理,給藥方法同IR組。

1.3 取材

將SD大鼠用水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉后,仰臥固定在動(dòng)物臺(tái)上。開胸后將灌注針頭插入,直至升主動(dòng)脈。先快速灌注溫?zé)嵘睇}水約50ml,后灌注約450ml 4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液進(jìn)行前固定。之后取腦,輕柔剝?nèi)‰p側(cè)海馬。預(yù)做原位末端標(biāo)記(TUNEL)凋亡的標(biāo)本于同種固定液中后固定6～12h,常規(guī)制成石蠟包埋塊。預(yù)做透射電鏡觀察的標(biāo)本固定在2.5%戊二醛中,4℃保存并于1周內(nèi)常規(guī)電鏡標(biāo)本包埋。預(yù)做mRNA測定和免疫印跡檢測的標(biāo)本置于-80℃凍存。

1.4 TUNEL凋亡檢測

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的地高辛標(biāo)記的脫氧脲苷酸(DIG-dUTP)缺口末端標(biāo)記法對凋亡的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行原位檢測。

1.5 透射電鏡觀察

海馬經(jīng)2.5%戊二醛及鋨酸后固定,按電鏡標(biāo)本制作,常規(guī)進(jìn)行包埋,取海馬冠狀面切片,每只大鼠隨機(jī)取4～5張切片,用日立-600型透射電鏡對海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察并拍片。透射電鏡在75kV 電壓,放大倍數(shù)在5000～20000倍條件下,觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的病理改變。

1.6 Bcl-2 和caspase-3 mRNA表達(dá)水平的測定

1.6.1 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄 按照TRIzol Reagent Kit操作說明書提取大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞總RNA,用酶標(biāo)儀于260nm處測定吸光度(A)值,并計(jì)算RNA濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件為42℃,60min；95℃,5min。所得cDNA產(chǎn)物于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank中大鼠β-actin、Bcl-2、caspase-3全序列,取其保守區(qū),按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物,引物序列由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。Bcl-2 mRNA 引物(163bp)序列： 上游5′-ACGGTGGTGGAGGAA CTCTT-3′,下游5′-GCAGATGCCGGTTCAGGTA-3′。Caspase-3引物擴(kuò)增產(chǎn)物(148bp)序列： 上游5′-A GAGCTGGACTGCGGTATTGAG-3′，下游5′-GAAC CATGACCCGTCCCTTG-3′。β-actin mRNA 引物擴(kuò)增產(chǎn)物(116 bp)序列： 上游5′-CTCATGCCATCCTG CGTCT-3′，下游5′-ACGCACGATTTCCCTCTCA-3′。

1.6.3 PCR擴(kuò)增 以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,按照qPCR Kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(15μl)包括： 模板(cDNA)1.5μl,2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 7.5μl,上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl,Nuclease-Free Water 5μl。PCR反應(yīng)條件為： 95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸50s,共39個(gè)循環(huán)。

1.7 免疫印跡檢測Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)水平

取保存于-80℃的海馬組織,稱重、提取CA1區(qū)組織蛋白；用BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo Pierce BCA Protein Assay Kit)檢測蛋白濃度；加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液,沸水中煮8min使蛋白變性；以12%的SDS聚丙烯酰胺分離膠和5%的濃縮膠電泳分離蛋白；濕法轉(zhuǎn)移到NC膜上；5%脫脂奶粉封閉90min；加入兔抗大鼠Bcl-2(1∶1000)、caspase-3(1∶1000),4℃孵育過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶10000),室溫下?lián)u床孵育60min；洗膜后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,以β-actin (Abbkine)為內(nèi)參。

1.8 圖像分析

在同一放大倍數(shù)(×40)、同一光強(qiáng)度下對海馬CA1區(qū)隨機(jī)抽取15個(gè)不重復(fù)視野,測定TUNEL陽性標(biāo)記的平均光密度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TUNEL神經(jīng)細(xì)胞凋亡

TUNEL染色I(xiàn)R組海馬CA1區(qū)于再灌注48 h可見大量陽性神經(jīng)細(xì)胞,呈散在分布,有些區(qū)域相對集中,陽性信號為胞核中的棕黃色顆粒；Sham組未見凋亡陽性細(xì)胞；EGb組凋亡陽性神經(jīng)細(xì)胞較IR組明顯減少(圖1A1～C1)。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)檢測,Sham組、IR組和EGb組神經(jīng)細(xì)胞凋亡陽性染色的平均光密度值分別為0.712±0.016、0.893±0.038和0.725±0.019。IR組凋亡陽性信號顯著強(qiáng)于Sham組(P<0.01)；EGb組凋亡陽性信號較IR組明顯減弱(P<0.01),EGb組與Sham組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 超微結(jié)構(gòu)

IR組可見細(xì)胞膜皺縮,胞質(zhì)電子密度升高,線粒體結(jié)構(gòu)較清楚,線粒體嵴較規(guī)整,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張,胞核形狀不規(guī)則,染色質(zhì)濃縮邊集或碎裂,核周膜不清,核膜皺縮; Sham組可見神經(jīng)細(xì)胞核大且圓,染色質(zhì)均勻分布,核仁清楚,核周隙清晰,核膜完整,胞質(zhì)內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)清晰,線粒體嵴排列整齊,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無擴(kuò)張,核糖體豐富,或附著于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),或游離散在分布；EGb組可見神經(jīng)細(xì)胞胞核清楚,染色質(zhì)分布較均勻,核膜完整,線粒體結(jié)構(gòu)清晰,線粒體嵴規(guī)整,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,核糖體較豐富,胞膜完整(圖1A2～C2)。

2.3 Bcl-2 和caspase-3 mRNA的表達(dá)水平

與Sham組相比,IR組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著下降,caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EGb組相較于IR組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高,caspase-3 mRNA表達(dá)水平則明顯降低(P<0.05)(圖2)。

2.4 Bcl-2和caspase-3的蛋白表達(dá)水平

與Sham組相比,IR組Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低,caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高；EGb組相較于IR組Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高,caspase-3蛋白表達(dá)水平則明顯降低(圖3)。

3 討論

缺血性腦血管疾病是危害人類健康與生命的常見病和多發(fā)病,尤其是缺血后的再灌注損傷對人類健康危害較大。腦缺血再灌注損傷是一種常見的臨床病理生理過程,在此過程中,除壞死外,還存在另一種細(xì)胞死亡形式,即細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞凋亡可能在缺血再灌注損傷的病理過程中起著重要的作用[10-11]。近年來,細(xì)胞死亡機(jī)制已成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。自1972年美國病理學(xué)家Kerr等提出凋亡這一概念后,人們逐步認(rèn)識(shí)到細(xì)胞凋亡是由多基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程,具有重要的生物學(xué)意義[12-13]。

典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征表現(xiàn)為胞膜表面皺縮起泡或芽變,失去微絨毛,與鄰周細(xì)胞脫離聯(lián)系；胞質(zhì)電子濃度增高,線粒體結(jié)構(gòu)清晰,線粒體嵴增多；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大,核膜皺縮,染色質(zhì)濃縮邊集,其中核的改變是最早的形態(tài)改變[14]。壞死細(xì)胞表現(xiàn)為腫脹,胞膜不連續(xù),線粒體結(jié)構(gòu)模糊,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴(kuò)張呈泡狀,溶酶體破裂,染色質(zhì)邊集碎裂,核膜斷裂[15]。本實(shí)驗(yàn)TUNEL染色和透射電鏡結(jié)果顯示,在腦缺血再灌注48h,雖然存在極小數(shù)的神經(jīng)細(xì)胞壞死,但細(xì)胞凋亡仍是遲發(fā)性死亡期(DND)神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式[16]。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞TUNEL染色(A1～C1)和超微結(jié)構(gòu)(A2～C2)。A1： Sham組,細(xì)胞排列整齊,核大且圓,核仁清晰,無棕染的陽性神經(jīng)細(xì)胞；B1: IR組,有2處凋亡神經(jīng)細(xì)胞相對集中,胞核呈深棕黃色,另外可見數(shù)個(gè)核為棕色淡染的神經(jīng)細(xì)胞；C1: EGb組,細(xì)胞排列較規(guī)則,凋亡陽性細(xì)胞少見,胞核呈棕黃色深染,×40;A2： Sham組,核圓形,染色質(zhì)均勻分布,核膜完整,核周隙清晰,線粒體結(jié)構(gòu)清楚,線粒體嵴排列規(guī)整,核糖體豐富,×8000；B2: IR組,胞核形狀不規(guī)則,核膜連續(xù),染色質(zhì)濃縮、邊集,線粒體結(jié)構(gòu)較清楚,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴(kuò)張,×5000；C2: EGb組,核圓形,核膜連續(xù),有異染色質(zhì)附著于上,核周隙較清晰,線粒體嵴排列較規(guī)整,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,×20000.

Fig 1 TUNEL staining (A1-C1) and ultrastructure (A2-C2) in hippocampal CA1 neurons of rats in each group. A1： In sham group, cells were arranged in neat rows, with large and round nuclei, clear nucleoli, and there were non-brown-dyed positive neurons; B1: In IR group, there were two places where apoptotic nerve cells were relatively concentrated, and the nuclei were dark brown-yellow. In addition, there were a few of nerve cells with light brown nuclei; C1: In EGb group, the cell arrangement was relatively regular, apoptosis-positive cells were rare, and the nuclei were brownish dark-stained. ×40. A2： in sham group, the nucleus circle, the chromatin uniform distribution, the nuclear membrane integrity, the perinuclear space was clear, the mitochondrial structure was clear, mitochondrial ridge arrangement was neat, and the ribosomes were rich, ×8000; B2: In IR group, the nuclear shape was irregular, the nuclear membrane was continuous, chromatin concentration and edge set, the mitochondrial structure was clear, and the endoplasmic reticulum was highly dilated, ×5000; C2: In EGb group, the nucleus circle, the nuclear membrane was continuous with heterochromatin attached to it, the perinuclear space was clear, mitochondrial ridge arrangement was relatively regular, and the endoplasmic reticulum was slightly enlarged, ×20000.

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2和caspase-3 mRNA的表達(dá)

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2和caspase-3的蛋白

在腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性死亡期,線粒體是神經(jīng)細(xì)胞缺血受損的靶細(xì)胞器,線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡的第一步[17]。在線粒體凋亡途徑中,缺血再灌注后產(chǎn)生大量氧自由基攻擊線粒體,細(xì)胞色素C氧化酶去磷酸化,細(xì)胞色素C(Cyt-c)從線粒體進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì),激活凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1),活化的Apaf-1能夠激活caspase-9,而活化的caspase-9繼續(xù)激活下游的效應(yīng)分子caspase-3,啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[18]。caspase-3是一種特異的半胱氨酸蛋白酶,是線粒體凋亡通路下游的關(guān)鍵執(zhí)行者,caspase-3活化后能夠酶解、切割特異性底物如DNA依賴性蛋白酶(DNA-PK)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)等,通過改變它們的結(jié)構(gòu)或影響特定信號分子而引起細(xì)胞凋亡[19]。

在正常細(xì)胞中,Bcl-2基因產(chǎn)物主要定位在線粒體、核周模及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,發(fā)生凋亡時(shí),Bcl-2轉(zhuǎn)到線粒體外膜及其他細(xì)胞器膜上,與其他促凋亡蛋白如Bad結(jié)合或形成離子通道來維持線粒體外膜的完整性。Bcl-2能夠與Apaf-1、caspase-9結(jié)合形成三元復(fù)合物,阻斷細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì),抑制下游凋亡級聯(lián)反應(yīng),從而發(fā)揮抑制凋亡的作用[20]。本研究對Bcl-2和caspase-3的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平進(jìn)行檢測,結(jié)果提示EGb761可能通過下調(diào)caspase-3和上調(diào)Bcl-2的表達(dá)和活化來減少腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活。

EGb761是銀杏葉中提取的有效成分,近年來研究表明,EGb761對腦缺血損傷具有抗過氧化、減輕興奮性氨基酸毒性等廣泛的生物活性[21],其對抗的這些不利因素都是凋亡發(fā)生的易感因素。本實(shí)驗(yàn)采用100mg/kg 的劑量,連續(xù)7 d用EGb761對SD大鼠進(jìn)行灌胃預(yù)處理,結(jié)果顯示TUNEL染色陽性神經(jīng)細(xì)胞明顯減少,未見壞死神經(jīng)細(xì)胞；caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)減弱,Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)增強(qiáng)；神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理改變的明顯改善,程度也明顯減輕,由此可推測EGb761對腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有顯著的保護(hù)作用。EGb761對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能是多方面的,本研究僅從caspase-3、Bcl-2兩個(gè)凋亡相關(guān)基因進(jìn)行了研究,并探索了其可能的作用機(jī)制,而這些機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的探討,以明確這種保護(hù)作用是否具有劑量和時(shí)間依賴性。