劉芳，閆宇，李雅楠，戴亮，肖永紅*

乙型肝炎病毒（HBV）感染是我國(guó)最嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。我國(guó)目前約有HBV感染者7 000多萬(wàn)，乙型肝炎（以下簡(jiǎn)稱乙肝）患者2 000萬(wàn)～3 000萬(wàn)［1］，若不給予有效的治療，25%～40%的慢性乙肝患者會(huì)進(jìn)展為肝硬化或原發(fā)性肝癌甚至死亡［2］。而HBV-DNA載量是預(yù)測(cè)HBV感染最直接且特異度、靈敏度高的指標(biāo)；肝功能指標(biāo)可以在一定程度上反映肝臟的損傷程度；且有研究表明，HBV感染可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）［3］。為此，本研究選取唐山市傳染病醫(yī)院乙肝患者及非HBV感染患者，比較不同血清HBVDNA載量乙肝患者的肝功能及外周血ERS相關(guān)指標(biāo)變化，分析血清HBV-DNA載量對(duì)肝功能及ERS的影響，為乙肝的臨床診治提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年7月—2017年6月在唐山市傳染病醫(yī)院治療的乙肝患者136例。其中男71例，女65例，男女比例為1∶0.9；年齡18～70歲，平均（39.8±11.9）歲。按血清HBV-DNA載量將患者分為陰性組（血清HBV-DNA載量＜1.0×103copies/ml）、低拷貝組（1.0×103copies/ml≤血清HBV-DNA載量＜1.0×105copies/ml）、中拷貝組（1.0×105copies/ml≤血清HBV-DNA載量＜1.0×107copies/ml）、高拷貝組（血清HBV-DNA載量≥1.0×107copies/ml）［4］。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》［5］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒感染者；（2）合并脂肪肝、代謝性肝病、自身免疫性肝炎、酒精性肝病者；（3）有心、肺、腦、腎等嚴(yán)重疾病者；（4）合并其他惡性腫瘤者；（5）合并其他自身免疫性疾病者。

同期選取在唐山市傳染病醫(yī)院治療的非HBV感染患者82例為對(duì)照組。其中男45例，女37例，男女比例為1∶0.8；年齡18～77歲，平均（39.2±12.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：非HBV感染的新入院患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：同乙肝患者的排除標(biāo)準(zhǔn)。

所有研究對(duì)象簽署知情同意書，本研究經(jīng)華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者一般資料，包括性別、年齡。

1.2.2 血液標(biāo)本采集 抽取患者入院當(dāng)天清晨空腹靜脈血5 ml，全血標(biāo)本室溫放置2 h或4 ℃冰箱過(guò)夜后3 000 r/min離心20 min（離心半徑10 cm），取上清液，置于-80 ℃冰箱凍存待用。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 血清HBV-DNA載量檢測(cè) 取500 μl血清至1.5 ml滅菌離心管，再取100 μl血清加入等量的DNA濃縮液（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）至1.0 ml的滅菌離心管內(nèi)，震蕩混勻5 s，6 000 r/min離心20 s（離心半徑10 cm），去上清液，加入30 μl的DNA提取液，靜置30 min后，震蕩5～10 s，放入100 ℃的恒溫箱中保溫10 min，10 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），使用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）擴(kuò)增，使用乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，本試劑盒的最低檢出限濃度為30 copies/ml，最低定量濃度為100 copies/ml）、PCR-熒光探針?lè)z測(cè)血清HBV-DNA載量。

1.2.3.2 肝功能指標(biāo)檢測(cè) 采用Hitachi 7170全自動(dòng)生化儀（日本日立公司）檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶（ALP），嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書操作。

1.2.3.3 ERS相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)ERS相關(guān)指標(biāo)——葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CHOP）、天冬半胱氨酸特異性蛋白酶-12（caspase-12），ELISA試劑盒由北京冬歌生物科技有限公司提供，按試劑盒說(shuō)明書操作，具體步驟如下：（1）將所需板條在室溫下平衡20 min；（2）設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；（3）樣品孔先加待測(cè)樣品10 μl，再加樣本稀釋液40 μl，空白孔不加；（4）除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl，封固，37 ℃溫育60 min；（5）洗板5次；（6）每孔加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min；（7）每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處用SpectraMax M5酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）測(cè)定各孔的OD值。以試劑盒中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel 2013建立數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；兩變量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組血清HBV-DNA載量分別為（185.0±145.7）、（1.8×104±2.7×104）、（2.5×106±2.7×106）、（3.0×108±1.8×108）copies/ml，患者例數(shù)分別為 42、33、29、32例。5組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表1）。

2.2 5組肝功能指標(biāo)比較 5組ALT、AST、γ-GT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；5組ALP比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組ALT、AST高于對(duì)照組、陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中拷貝組、高拷貝組ALT、AST高于低拷貝組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高拷貝組ALT、AST高于中拷貝組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組γ-GT高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

表1 5組一般資料比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of general data in each group

表2 5組肝功能指標(biāo)比較（x±s，U/L）Table 2 Comparison of liver function indexes in each group

2.3 5組ERS相關(guān)指標(biāo)比較 5組GRP78、CHOP、caspase-12比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組GRP78、CHOP、caspase-12高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低拷貝組GRP78低于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中拷貝組GRP78高于低拷貝組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

表3 5組ERS相關(guān)指標(biāo)比較（x±s）Table 3 Comparison of ERS related indexes in each group

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 肝功能指標(biāo)與血清HBV-DNA載量相關(guān)性分析ALT、AST與血清HBV-DNA載量均呈正相關(guān)（P＜0.05）；γ-GT、ALP與血清HBV-DNA載量無(wú)直線相關(guān)關(guān)系（P＞0.05，見(jiàn)表4）。

2.4.2 肝功能指標(biāo)與ERS相關(guān)指標(biāo)相關(guān)性分析 ALT、AST、γ-GT、ALP與GRP78、CHOP、caspase-12均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系（P＞0.05，見(jiàn)表4）。

表4 肝功能指標(biāo)與血清HBV-DNA載量及ERS相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between liver function and HBV-DNA load and ERS indexes

3 討論

病毒性肝炎位居我國(guó)傳染病發(fā)病率之首，原國(guó)家衛(wèi)計(jì)委數(shù)據(jù)顯示，乙肝患者占所有肝炎患者的80%，我國(guó)每年因乙肝所致直接經(jīng)濟(jì)損失至少500億元［6］。乙肝的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，現(xiàn)階段研究表明，其發(fā)病機(jī)制主要是HBV的不斷復(fù)制、持續(xù)表達(dá)和釋放抗原引起肝細(xì)胞的持續(xù)性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致纖維組織持續(xù)增生，使肝細(xì)胞纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化［7］。若不接受及時(shí)有效的治療，25%～40%的慢性乙肝患者可進(jìn)展為肝硬化或原發(fā)性肝癌并最終導(dǎo)致死亡［2］。研究顯示，多種疾病的發(fā)生均與ERS有關(guān)，而肝細(xì)胞中含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，許多肝臟疾病如病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎、非酒精性脂肪肝等的發(fā)病機(jī)制均涉及ERS［8］。因此，本研究比較不同血清HBV-DNA載量乙肝患者的肝功能及外周血ERS相關(guān)指標(biāo)變化，分析血清HBV-DNA載量對(duì)肝功能及外周血ERS相關(guān)指標(biāo)的影響，以期為乙肝的臨床診治提供借鑒。

血清HBV-DNA陽(yáng)性提示HBV復(fù)制和有傳染性。血清HBV-DNA載量越高表示病毒復(fù)制越厲害，傳染性越強(qiáng)。血清HBV-DNA載量及ALT等指標(biāo)均是反映乙肝患者肝功能的重要指標(biāo)［9］。本研究結(jié)果顯示，低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組ALT、AST高于對(duì)照組、陰性組，中拷貝組、高拷貝組ALT、AST高于低拷貝組，高拷貝組ALT、AST高于中拷貝組；陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組γ-GT高于對(duì)照組；5組ALP無(wú)差異。表明HBV的復(fù)制確實(shí)會(huì)在一定程度上影響肝功能，這與相關(guān)研究結(jié)果一致［10］。分析其原因可能為HBV感染會(huì)引起肝細(xì)胞損傷，而目前關(guān)于其機(jī)制的研究有以下兩種觀點(diǎn)：（1）肝細(xì)胞表面HBV抗原可引起人體的免疫應(yīng)答，造成肝細(xì)胞損傷；（2）病毒大量復(fù)制造成其中間產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)累積，引發(fā)肝細(xì)胞損傷［11］。本研究結(jié)果亦顯示，ALT、AST與血清HBVDNA載量均呈正相關(guān)，但其相關(guān)程度并不是很強(qiáng)（r值均＜0.500），而γ-GT、ALP與血清HBV-DNA載量無(wú)直線相關(guān)關(guān)系，可能與在分析過(guò)程中未將乙肝患者按臨床分期分組統(tǒng)計(jì)有關(guān)，這需要后續(xù)研究進(jìn)一步完善。

ERS通過(guò)誘導(dǎo)CHOP表達(dá)、GRP78及caspase-12的活化等一系列生物學(xué)效應(yīng)信號(hào)使細(xì)胞由生存向凋亡轉(zhuǎn)變。GRP78的迅速升高被認(rèn)為是ERS最敏感的指標(biāo)［12］。CHOP是聯(lián)系ERS與細(xì)胞凋亡的重要中間信號(hào)分子，caspase-12僅在ERS時(shí)被活化，是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，是ERS特有的凋亡途徑［13］。既往體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，HBV可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生ERS［14-15］，但是相關(guān)臨床試驗(yàn)甚少［16］。本研究結(jié)果顯示，陰性組、低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組GRP78、CHOP、caspase-12高于對(duì)照組，這進(jìn)一步在人體中證明了HBV可誘發(fā)ERS。但是本研究發(fā)現(xiàn)ALT、AST、γ-GT、ALP與GRP78、CHOP、caspase-12均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系，分析這一結(jié)果的原因可能為ERS相關(guān)指標(biāo)反映的是肝細(xì)胞的凋亡，而病毒復(fù)制的程度與肝細(xì)胞的凋亡進(jìn)程并不一致。HBV感染的病程可分為4個(gè)階段，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動(dòng)期及再活躍期。在免疫耐受期，血清HBV-DNA復(fù)制活躍，肝組織學(xué)無(wú)明顯異常或僅有輕度異常；在免疫清除期，免疫耐受消失進(jìn)入免疫活躍期，血清HBV-DNA載量下降，肝組織開(kāi)始出現(xiàn)炎性壞死等；進(jìn)入非活動(dòng)期后，檢測(cè)不到血清HBV-DNA載量或血清HBV-DNA載量低于檢測(cè)下限，肝細(xì)胞壞死及炎癥可緩解；部分患者會(huì)進(jìn)入再活躍期，導(dǎo)致血清HBVDNA載量再次上升。

綜上所述，乙肝患者血清HBV-DNA載量可對(duì)肝功能產(chǎn)生影響，且可誘發(fā)外周血ERS，這對(duì)乙肝的發(fā)病機(jī)制研究及臨床診治有一定的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。但是，本研究所納入的樣本量有限，且僅對(duì)外周血ERS相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，在今后的研究中可擴(kuò)大樣本量，對(duì)乙肝患者進(jìn)行更為細(xì)致的分期研究，并檢測(cè)肝組織中ERS相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，以彌補(bǔ)本研究的不足之處，進(jìn)一步探索ERS在乙肝發(fā)病及進(jìn)展中的作用。

志謝：感謝唐山市傳染病醫(yī)院劉福忠、李小林老師在數(shù)據(jù)收集及標(biāo)本采集過(guò)程中給予的幫助與支持。