胡發(fā)根,沈 麗,吉華蘭,羅 林,王立梅,齊 斌,朱益波,*

(1.蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇蘇州 215000;2.常熟理工學(xué)院 蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,江蘇常熟 215500)

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重組大腸桿菌全細(xì)胞合成苯基乳酸的研究

胡發(fā)根1,2,沈 麗2,吉華蘭2,羅 林2,王立梅2,齊 斌2,朱益波2,*

(1.蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇蘇州 215000;2.常熟理工學(xué)院 蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,江蘇常熟 215500)

在E.coliBL21(DE3)中過量表達(dá)D-乳酸脫氫酶基因(D-ldh),并優(yōu)化該重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸鈉合成苯基乳酸的條件。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,并在此基礎(chǔ)上對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸鈉合成苯基乳酸進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,菌體OD600為1.2時(shí)添加IPTG至終濃度0.2mmol/L,25℃誘導(dǎo)4h后收集菌體具有最佳轉(zhuǎn)化活性；最優(yōu)分批轉(zhuǎn)化條件:pH7.0,8.0g/L苯丙酮酸鈉,20g/L葡萄糖,1%(v/v)吐溫-80,菌體濃度20g/L(干重),37℃,轉(zhuǎn)速200r/min轉(zhuǎn)化0.5h,苯基乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到4.91g/L,56%。在上述優(yōu)化條件上通過流加苯丙酮酸鈉和葡萄糖,經(jīng)6h轉(zhuǎn)化,苯基乳酸最終產(chǎn)量達(dá)到17.23g/L,轉(zhuǎn)化率為54%。研究結(jié)果表明該重組大腸桿菌成功轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成苯基乳酸,具有較好的應(yīng)用前景,為系統(tǒng)化代謝工程改造大腸桿菌生物合成苯基乳酸的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了有用的技術(shù)參數(shù)。

大腸桿菌,D-乳酸脫氫酶,苯基乳酸,全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化

苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA),也稱3-苯基乳酸或2-羥基-3-苯基丙酸,是一種廣泛存在于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品和蜂蜜中的有機(jī)酸[1-3]。大量研究表明苯基乳酸可以有效抑制包括食源性致病細(xì)菌,如Listeriamonocytogenes、Enterococcusfaecalis、Staphylococcusaureus、Escherichiacoli、Providenciastuartii、Klebsiellaoxytoca,酵母和霉菌,如Aspergillusochraceus、Penicilliumroqueforti、Penicilliumcitrinu等多種微生物的生長(zhǎng)[4-7]。此外,苯基乳酸在飼料添加劑[8-9]、醫(yī)藥[10]、化妝品等多方面都具有廣泛的應(yīng)用前景。這種由乳酸菌代謝產(chǎn)生的芳香族有機(jī)酸不僅對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞均無毒性,還具有抑菌譜廣,水溶性和熱穩(wěn)定性好,作用pH范圍寬等特點(diǎn),有望作為理想的食品防腐劑而獲得研究人員的廣泛關(guān)注[11]。

目前為止,用于苯基乳酸轉(zhuǎn)化的微生物主要有真菌(Geotrichumcandidum)[12],乳酸菌(Lactobacillus,Enterococcus,Weissella,Leuconostoc),丙酸菌(PropionibacteriumjenseniiDSMZ 20535,P.thoeniiDSMZ 20276)[13]等,其中來自L.plantarumSK002[14],BacilluscoagulansSDM[15]的L-乳酸脫氫酶和來自P.acidilacticiDSM 20284,L.plantarumSK002[14],Lactobacillusconfusus[16],B.coagulansSDM[15]的D-乳酸脫氫酶,具有催化苯丙酮酸合成苯基乳酸的能力。但由于乳酸脫氫酶在微生物體內(nèi)的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控而致使胞內(nèi)乳酸脫氫酶含量較低,限制了苯基乳酸產(chǎn)量的提高。因此,利用基因工程技術(shù)獲得高效表達(dá)乳酸脫氫酶的工程菌可能是提高苯基乳酸產(chǎn)量的有效途徑。

本研究將來自L.plantarum的D-ldh克隆到大腸桿菌中過表達(dá),以苯丙酮酸鈉為底物,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸。通過對(duì)基因表達(dá)條件和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,全細(xì)胞合成苯基乳酸,并取得較好結(jié)果,為系統(tǒng)化代謝工程改造大腸桿菌生物合成苯基乳酸的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑 D-3-苯基乳酸和苯丙酮酸標(biāo)品 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；酵母提取物,胰蛋白胨 購(gòu)自O(shè)xoid公司(英國(guó))；DNA聚合酶,硫酸卡那霉素,氨芐青霉素和相關(guān)分子試劑盒 購(gòu)自上海生工；限制性內(nèi)切酶 購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa),所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無特殊說明均為分析純。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum(CGMCC:1.2437) 購(gòu)自中國(guó)菌種保藏中心(CGMCC)；pMD19-T Simple Vector 購(gòu)自寶生物公司(大連)；E.coliDH5α,E.coliJM109,E.coli BL21(DE3),pET-28a(+)均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀、水平電泳系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-RAD公司；高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司；恒溫金屬浴 德國(guó)Eppendorf公司；高效液相色譜儀 日本島津公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

1.2 重組菌株的構(gòu)建與誘導(dǎo)條件優(yōu)化

1.2.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建表達(dá)和功能驗(yàn)證 以植物乳桿菌基因組為模板,上游引物(P1:5′-CGCGGATCCATGAAAATTATTGCATATGC-3′)引入BamH I酶切位點(diǎn),下游引物(P2:5′-CCCAAGC TTTTAATCAAACTTAACTTGTG-3′)引入Hind III酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為996bp的DNA片段,連接入克隆質(zhì)粒pMD19-T Simple Vector并轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109,篩選陽性克隆,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后由BamH I和Hind III雙酶切,連接經(jīng)相同酶切處理的線性表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+),得到重組質(zhì)粒命名為pET28a-D-ldh,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21(DE3),重組子經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后命名為E.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh。

將活化的重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh和空載體對(duì)照E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)按1%的接種量接種到裝有100mL LB液體培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素)的搖瓶中,37℃、200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8,加入1.0mmol/L誘導(dǎo)劑25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后,4℃、6000r/min離心10min,收集菌體用pH7.0磷酸鉀緩沖液洗滌2次,重懸于10mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,反應(yīng)1h后取樣用高效液相色譜檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。同時(shí)取適量菌體SDS-PAGE分析乳酸脫氫酶表達(dá)情況。

1.2.2 乳酸脫氫酶誘導(dǎo)條件優(yōu)化 采用單因素實(shí)驗(yàn)在搖瓶中考察誘導(dǎo)劑濃度,誘導(dǎo)溫度,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)全細(xì)胞合成苯基乳酸的影響。重組大腸桿菌基礎(chǔ)誘導(dǎo)條件:OD600為0.6時(shí)添加IPTG至0.6mmol/L,25℃誘導(dǎo)4h。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件(表1)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

在優(yōu)化的誘導(dǎo)條件基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件。分別考察磷酸緩沖液pH、細(xì)胞干重、起始底物濃度、轉(zhuǎn)化溫度對(duì)轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成苯基乳酸的影響。優(yōu)化前基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化條件:pH6.5,細(xì)胞干重10g/L,底物濃度9g/L,轉(zhuǎn)化溫度37℃。

1.4 搖瓶中流加轉(zhuǎn)化

在最優(yōu)的誘導(dǎo)條件和轉(zhuǎn)化條件下,將菌體懸浮于50mL轉(zhuǎn)化液,菌體干重20g/L,苯丙酮酸和葡萄糖起始濃度分別為8,20g/L。分別在0、0.5h添加0.4g苯丙酮酸鈉,在1、1.5、2、4h添加0.2g的苯丙酮酸鈉,定時(shí)取樣。

1.5 高效液相色譜檢測(cè)

苯丙酮酸鈉、苯基乳酸和葡萄糖的檢測(cè):取一定量轉(zhuǎn)化液于4℃、12000r/min離心20min,上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù),經(jīng)0.22μm濾膜過濾后高效液相(島津,LC-20A)檢測(cè)。色譜條件:色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H有機(jī)酸分析柱；流動(dòng)相為5mmol/L稀硫酸；流速0.6mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣體積5μL,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。其中苯丙酮酸鈉和苯基乳酸用紫外檢測(cè)器檢測(cè),葡萄糖用RID-10A示差檢測(cè)器檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建與功能驗(yàn)證

用于本研究的Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum(CGMCC:1.2437)乳酸脫氫酶基因(D-ldh)編碼332個(gè)氨基酸。E.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh經(jīng)1mmol/L IPTG、25℃誘導(dǎo)表達(dá)4h收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。該重組菌在近41ku處有明顯蛋白條帶(圖1,泳道2),相對(duì)分子質(zhì)量和預(yù)期的大小一致,表明乳酸脫氫酶在大腸桿菌中表達(dá)成功。

圖1 SDS-PAGE分析乳酸脫氫酶蛋白表達(dá)Fig.1 The analysis of D-lactate dehydrogenase protein by SDS-PAGE注:M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;1:未誘導(dǎo)的重組菌;2:經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌;3:空質(zhì)粒菌株;4:原始菌株。

重組大腸桿菌和對(duì)照菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化見圖2,重組大腸桿菌苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到5.01g/L,比未經(jīng)過誘導(dǎo)的重組菌提高了4倍多。而值得注意的是原始菌株BL21(DE3)和含有空質(zhì)粒的大腸桿菌也有一定的轉(zhuǎn)化能力,分別達(dá)到0.71g/L和0.63g/L,可能是胞內(nèi)也有一定水平乳酸脫氫酶或其它酶系對(duì)苯丙酮酸也有一定的轉(zhuǎn)化能力。結(jié)果表明,在大腸桿菌中表達(dá)外源乳酸脫氫酶顯著增強(qiáng)了全細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力。

圖2 不同菌株生物合成苯基乳酸的影響Fig.2 The bioconversion effect of native strains and recombinant strains

2.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)合成苯基乳酸的影響 當(dāng)IPTG濃度為0.2mmol/L時(shí),苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到近2.7g/L(圖3A)。此后隨著誘導(dǎo)劑濃度的加大,苯基乳酸產(chǎn)量逐漸下降,值得注意的是菌體密度也發(fā)生了不同程度的下降,當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度為0.8mmol/L時(shí),菌體密度相對(duì)0.2mmol/L誘導(dǎo)劑時(shí)降低了19%,說明誘導(dǎo)劑濃度過大,對(duì)重組菌的生長(zhǎng)有抑制作用。

2.2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)合成苯基乳酸的影響 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí),苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大(圖3B)。升高誘導(dǎo)溫度,雖然菌體干重進(jìn)一步提高,但是該重組菌的轉(zhuǎn)化效率并沒有隨著菌體濃度的升高而升高,當(dāng)誘導(dǎo)溫度為35℃時(shí)苯基乳酸產(chǎn)量只有25℃的54%。這充分說明誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化活性有顯著影響。故采用25℃低溫誘導(dǎo)有利于苯基乳酸的合成。

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)合成苯基乳酸的影響 合理的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)不僅有利于乳酸脫氫酶大量表達(dá),還有利于菌體的大量獲得。起始誘導(dǎo)時(shí)機(jī)影響重組大腸桿菌合成苯基乳酸結(jié)果見圖3C,當(dāng)菌體誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600為0.8時(shí),苯基乳酸達(dá)到1.83g/L。

2.2.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)合成苯基乳酸的影響 誘導(dǎo)時(shí)間影響重組大腸桿菌合成苯基乳酸結(jié)果見圖3D所示,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,菌體濃度都有了一定程度的提高,但誘導(dǎo)時(shí)間超過6h后,苯基乳酸的產(chǎn)量開始下降。其原因可能是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性開始下降。

圖3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of induction condition注:A:誘導(dǎo)劑濃度對(duì)苯基乳酸生產(chǎn)的影響;B:誘導(dǎo)溫度對(duì)苯基乳酸生產(chǎn)的影響;C:誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)苯基乳酸生產(chǎn)的影響;D:誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)苯基乳酸生產(chǎn)的影響。

2.2.5 正交優(yōu)化 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。極差數(shù)據(jù)表明,相對(duì)于誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間,誘導(dǎo)溫度對(duì)苯基乳酸的合成影響最顯著,而誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)結(jié)果影響不大,故采用最佳的誘導(dǎo)條件組合為:誘導(dǎo)溫度25℃、誘導(dǎo)劑濃度0.2mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為菌體濃度OD600達(dá)到1.2時(shí)添加誘導(dǎo)劑,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到5.0g/L。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table2 Results of orthogonal experimentals

2.3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

在最佳的誘導(dǎo)條件下,考察了重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中影響苯基乳酸產(chǎn)量的因素。結(jié)果見圖4,最優(yōu)pH為7.0,最佳轉(zhuǎn)化溫度為37℃,最佳的底物濃度為8g/L,最佳的生物量為20g/L。同時(shí)對(duì)表面活性劑吐溫-80在生物轉(zhuǎn)化中對(duì)苯基乳酸合成影響的研究結(jié)果見圖5,和對(duì)照組相比,在轉(zhuǎn)化開始時(shí)向轉(zhuǎn)化液中添加不同濃度的吐溫-80,苯基乳酸產(chǎn)量均有不同程度的提升。當(dāng)吐溫-80達(dá)到1%(v/v)時(shí),苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到4.91g/L,比對(duì)照組的3.8g/L提高了29%,轉(zhuǎn)化率也達(dá)到了56%。這是因?yàn)橥聹?80是一種非離子型表面活性劑,與細(xì)胞膜相互作用改變了細(xì)胞膜的通透性,有利于底物輸入和產(chǎn)物輸出。然而濃度過高可能會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性,對(duì)微生物有抑制或殺死作用[17]。

圖4 生物轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of bioconversion conditions注:A:pH對(duì)苯基乳酸生產(chǎn)的影響;B:轉(zhuǎn)化溫度對(duì)苯基乳酸生產(chǎn)的影響;C:底物濃度對(duì)苯基乳酸生產(chǎn)的影響;D:生物量對(duì)苯基乳酸生產(chǎn)的影響。

圖5 吐溫-80對(duì)轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸的影響Fig.5 Effect of Tween-80 on PLA production

2.4 底物流加強(qiáng)化苯基乳酸合成

通過分批添加底物可以有效避免轉(zhuǎn)化過程中的底物抑制,有利于產(chǎn)物的合成。在反應(yīng)的前1h,苯丙酮酸鈉快速轉(zhuǎn)化成苯基乳酸(圖6)。隨后,菌體轉(zhuǎn)化活力逐漸下降,經(jīng)6h轉(zhuǎn)化和底物添加,最終苯基乳酸濃度為17.23g/L,生產(chǎn)率為2.87g/L/h,轉(zhuǎn)化率達(dá)到54%。與乳酸菌Lactobacillussp. SK007,L.plantarumCRL 778,L.plantarum1081[13]相比,本研究獲得的重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系簡(jiǎn)單,產(chǎn)物易于純化,生產(chǎn)強(qiáng)度大,轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)。但另一方面,該工程菌有效轉(zhuǎn)化時(shí)間短,從而限制了該重組菌的最終產(chǎn)物濃度以及底物轉(zhuǎn)化率。來自植物乳桿菌的乳酸脫氫酶為NADH依賴型的脫氫酶[18],在轉(zhuǎn)化苯丙酮酸的過程中,需要輔酶NADH的參與,該重組菌轉(zhuǎn)化時(shí)間短的原因之一可能是由胞內(nèi)缺乏輔因子所引起。Shuhuai Yu[18]報(bào)道將來自戊糖片球菌D-乳酸脫氫酶中加入甲酸脫氫酶進(jìn)行雙酶反應(yīng)可以顯著提高苯基乳酸產(chǎn)量。本研究首次將重組大腸桿菌全細(xì)胞運(yùn)用于合成苯基乳酸的研究,與Wanmeng Mu[19-20]報(bào)道運(yùn)用Lactobacillussp.SK007通過培養(yǎng)基優(yōu)化和底物流加策略發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸(17.38g/L)產(chǎn)量接近,比其轉(zhuǎn)化率51.1%有所提高。但和Zhaojuan Zhan[15]報(bào)道用凝結(jié)芽孢桿菌(BacilluscoagulansSDM)全細(xì)胞生產(chǎn)苯基乳酸(產(chǎn)量37.3g/L,轉(zhuǎn)化率70%)相比,產(chǎn)量和產(chǎn)率還有待進(jìn)一步提高。本研究的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面。第一,大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主,遺傳背景清晰,技術(shù)操作簡(jiǎn)單,培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,生長(zhǎng)周期短等特點(diǎn)有利于對(duì)大腸桿菌進(jìn)行代謝工程改造,如通過胞內(nèi)輔因子再生提高苯基乳酸的產(chǎn)量。第二,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)需要培養(yǎng)大量的菌體,大腸桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)比較成熟,為苯基乳酸工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

圖6 底物流加培養(yǎng)生產(chǎn)苯基乳酸的時(shí)間曲線Fig.6 Time course of PLA production in fed-batch fermentation with intermittent PPA feeding

3 結(jié)論

目前,苯基乳酸的研究主要集中于高產(chǎn)菌種的篩選,不同來源微生物脫氫酶的研究和發(fā)酵策略的改善。本研究利用基因工程技術(shù)成功將Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum(CGMCC:1.2437)D-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中克隆表達(dá),并將該重組大腸桿菌全細(xì)胞運(yùn)用于苯基乳酸的合成。搖瓶轉(zhuǎn)化結(jié)果表明,以苯丙酮酸鈉為底物,在最優(yōu)的誘導(dǎo)條件和轉(zhuǎn)化條件下,苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到17.23g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到54%。Lactobacillussp.SK007[3,19]全細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸產(chǎn)量為1.12g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到56%,而通過培養(yǎng)基的優(yōu)化苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到2.30g/L,轉(zhuǎn)化率僅為46%。同國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有報(bào)道相比,本文苯基乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都達(dá)到了較高水平,為進(jìn)一步代謝工程改造大腸桿菌生物合成苯基乳酸奠定了基礎(chǔ)。

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Production of phenyllactic acid by using whole-cell recombinantEscherichiacoli

HU Fa-gen1,2，SHEN Li2，JI Hua-lan2，LUO Lin2，WANG Li-mei2，QI Bin2,ZHU Yi-bo2,*

(1.School of Biology and Basic Medical Sciences,Soochow University,Suzhou 215000,China;2.Research Center of Fermentation Engineering,Key Laboratory of Food and Biotechnology,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

D-lactate dehydrogenase was expressed in recombinantEscherichiacoliBL21(DE3),the expression conditions and bioconversion medium were optimized for the production of PLA with whole-cell transformation. Single factor experiments and orthogonal experiments were used to optimize induction conditions and the transformation conditions with the engineered whole-cells transformation. The optimized induction condition for D-ldhexpression was IPTG 0.2mmol/L and inducing for 4h at 25℃ and OD6001.2,the optimized batch reaction conditions in phosphate buffer(pH7.0)were:8g/L PPA,20g/L glucose,20g/L(dry cell weight),1% Tween-80,37℃,200r/min for 0.5h with PLA production of 4.91g/L and conversion ratio of 56%. Based on the above optimized conditions,fed-batch fermentation was conducted by intermittent feed PPA and glucose. After 6h transformation,the final PLA concentration reached 17.23g/L with the conversion ratio of 54%. Results showed that PPA was efficiently transformed into PLA through engineeredE.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh. This study not only showed a good industrial application prospect,but also laid a foundation for metabolic engineering ofE.colifor the production of PLA.

Escherichiacoli;D-lactate dehydrogenase;phenyllactic acid;whole-cell bioconversion

2014-07-28

胡發(fā)根(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)。

*通訊作者:朱益波(1980-)，男，博士，副教授，主要研究微生物轉(zhuǎn)化和相關(guān)微生物改造。

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2013GB2C100176);江蘇省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(BK20130380);江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(13KJB550002);江蘇省“六大高峰人才”資助計(jì)劃項(xiàng)目(NY-021)；蘇州市科技支撐計(jì)劃(SNG201354)；常熟市科技發(fā)展計(jì)劃(CN201220)。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0147-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.024