楊忠順 林易凡

（廣東省深圳中學 廣東深圳 518001）

“觀察DNA 和RNA 在細胞中的分布”是課程標準必修1“活動建議”里的一個重要實驗［1］。 該實驗原理是利用甲基綠、 吡羅紅與DNA 和RNA的親和力不同， 將DNA 與RNA 分別染成綠色和紅色。染色后在光學顯微鏡下觀察，綠色主要分布在細胞核，紅色主要分布在細胞質(zhì)，從而讓學生得出DNA 主要分布在細胞核中， 而RNA 主要分布在細胞質(zhì)中的結(jié)論。

1 實驗教學中存在的問題

教材設(shè)計的實驗，材料來源容易，適于大多數(shù)地區(qū)采用［2］。實驗教學時，即使嚴格根據(jù)教材的步驟操作，許多學生仍觀察不到理想的實驗結(jié)果。使用人口腔上皮細胞為實驗材料時， 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)情況下細胞核也被染成紅色，不能達到區(qū)分DNA與RNA的效果； 而用洋蔥內(nèi)表皮細胞做實驗材料時，教材并未給出詳細步驟，參照口腔上皮細胞，不經(jīng)酒精燈烘烤，30℃條件下用8%鹽酸解離5 min 后再染色， 發(fā)現(xiàn)洋蔥表皮細胞細胞核也十分容易被染成紅色， 而且還有質(zhì)壁分離的現(xiàn)象出現(xiàn)。 此外，使用預混的甲基綠-吡羅紅染料（由公司購買，在保質(zhì)期內(nèi)使用），直接進行染色，鏡檢過程中會發(fā)現(xiàn)有大量深色顆粒，影響觀察。

使用8%鹽酸解離易使細胞核也染成紅色的問題，康思婷的研究結(jié)果提到了多種可能［3］。首先鹽酸解離過程中易使DNA 變形，其次是pH 值對染料染色的影響，最后是DNA 在高溫條件下易變性。 俞如旺等的研究結(jié)果顯示，烤干與烘干，經(jīng)過鹽酸解離都會使細胞核染為紅色［4］。 而不經(jīng)鹽酸解離， 使用中性的生理鹽水或pH 值在7.35 左右的磷酸緩沖液環(huán)境承載口腔上皮細胞， 染色均不受影響（后文中有相關(guān)實驗證明）。 因此判斷使細胞核染為紅色的原因， 可能主要在于鹽酸解離過程中導致的DNA 變形，DNA 由于變形解旋為單鏈，使得其與吡羅紅的親和力大幅增加，而與甲基綠的親和力則大幅下降。

之前的文獻報道中提出的解決方案主要包括取消鹽酸解離的步驟或用醋酸緩沖液代替。 在實際操作中發(fā)現(xiàn)取消鹽酸解離的步驟， 直接染色的確能夠達到一定的效果， 但是對于人類口腔上皮細胞和洋蔥內(nèi)表皮細胞，染色較淺且不穩(wěn)定，偶有染不上色的情況； 對于洋蔥內(nèi)表皮細胞， 撕取的0.5 cm×0.5 cm的內(nèi)表皮， 染色中易浮在染液液滴之上，導致染色不均勻。

2 Triton X-100 作為透膜劑的探究實驗

Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）分子量為646.86，分子式為C34H62O11，是一種非離子型表面活性劑。在生物學和工業(yè)生產(chǎn)中常用作去垢劑，以增加細胞膜的通透性， 還能在此過程中保持膜蛋白的天然構(gòu)象。 Triton X-100 易購買，pH 值為中性， 性質(zhì)非常穩(wěn)定， 常溫下避光可以長時間保存。 基于以上原因，筆者嘗試探究TritonX-100 作為此實驗的透膜劑。

為了探究Triton X-100 作為透膜劑改善染色效果， 筆者設(shè)計了2 組實驗分別探究Triton X-100 在“觀察DNA 和RNA 在細胞中的分布”實驗中的使用濃度和透膜時間。 實驗材料選取更易觀察的洋蔥內(nèi)表皮細胞。

參考免疫細胞化學中的動物細胞透膜濃度，設(shè)置3 個Triton X-100 實驗組別， 濃度分別為0.1%、1%和10%， 除此之外還有8%鹽酸解離組別和不解離的對照組。

表1 洋蔥內(nèi)表皮細胞在不同條件下的解離

制備pH 值為7.35 左右的磷酸緩沖液（PBS）稀釋Triton X-100， 稀釋濃度分別為0.1%、1%和10%，其中0.5%～1%為免疫細胞化學中透膜的常用濃度， 而梯度兩端的濃度在設(shè)置上分別與常用濃度相差一個數(shù)量級， 以驗證過低或過高濃度對透膜的影響。 而在溫度選擇上，由于Triton X-100常作為表面活性劑使用， 應用中無需加熱， 因此Triton X-100 的透膜選取室溫進行，透膜時間5 min。透膜后使用清水緩慢沖洗10 s，然后染色。染色過程5 min，染色后用濾紙吸去多余染液，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察。 不解離對照組撕取洋蔥內(nèi)表皮后直接染色，吸去多余染液后鏡檢。

結(jié)果如圖1所示， 細胞核只有鹽酸解離組別呈紅色， 不解離與Triton X-100 透膜組別均為藍綠色，而細胞質(zhì)不解離組別著色最淺，隨著Triton X-100 濃度的增加， 著色越來越深，10% Triton X-100 組細胞質(zhì)已呈現(xiàn)為偏綠色， 而鹽酸解離組別質(zhì)壁分離明顯，細胞質(zhì)皺縮。 綜合上述結(jié)果，0.1%～1%的Triton X-100 均能在不影響細胞核著色的前提下，使細胞質(zhì)著色加深，故Triton X-100比較適宜的使用濃度為0.1%～1%。

圖1 不同Triton X-100 透膜濃度對洋蔥內(nèi)表皮細胞染色的影響

在確定Triton X-100 的適宜使用濃度后，繼續(xù)探究Triton X-100 透膜時間對洋蔥內(nèi)表皮細胞染色的影響。 共設(shè)置4 個時間梯度，分別為2min、5min、10min 和15min， 透膜后染色鏡檢過程同上述步驟。染色結(jié)果如圖2所示，隨著透膜時間的增加，細胞核的顏色變化不大，均成綠色，而細胞質(zhì)顏色則越來越深， 說明透膜時間的增加可以使染料更有效的結(jié)合RNA。 考慮到實驗課時間有限，染色時間控制在5min 比較合適，且能達到較好的透膜效果。

隨后驗證Triton X-100 在人類口腔上皮細胞染色中的作用。 用1%濃度的Triton X-100 透膜5 min（用1% 的Triton X-100 PBS 溶液代替生理鹽水，透膜后在烘箱中烘干，染色時間均為5 min）與直接染色相比，結(jié)果如圖3所示，透膜組胞質(zhì)著色偏紅，直接染色組胞質(zhì)著色較淺，個別細胞呈現(xiàn)藍綠色。

圖2 不同Triton X-100 透膜處理時間對洋蔥內(nèi)表皮細胞染色的影響

圖3 Triton X-100 透膜處理對人類口腔上皮細胞染色的影響

3 本實驗其他問題的改進方案

關(guān)于“觀察DNA 和RNA 在細胞中的分布”實驗效果不理想的問題，已有多篇文獻有過報道。首先是針對染料中有深色顆粒影響鏡檢的問題，通過過濾的方法，可以有效去除染液中的雜質(zhì)，使鏡檢過程中出現(xiàn)的深色顆粒狀物質(zhì)消失［5］。 在實際應用中筆者為提高過濾的效率和穩(wěn)定性， 采用了商品化的0.22 μm 濾器，使用60 mL 的一次性針管過濾，發(fā)現(xiàn)效果很好，效率很高，為一個班級過濾染液只需幾分鐘。

其次對于人類口腔上皮細胞實驗難度大、洋蔥內(nèi)表皮細胞實驗容易的問題，經(jīng)過實踐發(fā)現(xiàn)確實如此，因此很多報道推薦用洋蔥內(nèi)表皮細胞完全取代口腔上皮細胞進行實驗。相比于人類口腔上皮細胞， 洋蔥內(nèi)表皮細胞的確有細胞體積大，低倍鏡即可清楚觀察、 取材容易、 步驟簡便、肉眼下即可找到等優(yōu)勢。但是如果只使用植物細胞觀察，放棄動物細胞則未免有失偏頗，雖然教材沒有明確要求，但是作為統(tǒng)一的整體，動物和植物都有代表，會使學生對于核酸功能的普適性認識更加清楚，在教學中更有信服力。 由于取材都很容易，所以作者認為動、物植物細胞在本實驗中應該分組進行，再全班討論，加強學生對不同實驗材料區(qū)別和實驗結(jié)果共性的認識，從而達到更好的學習效果。

而對于人類口腔上皮細胞臨時裝片制作中酒精燈烤干過程中的問題， 有條件的學?？梢允褂?6～60℃烘箱烘干代替酒精燈烤干， 效果更佳，穩(wěn)定、可控。由于烤干的過程中火焰的大小、離火焰的距離和移動玻片的頻率對于烤干的效果都有較大影響，整個班級在操作過程中難免會有小組因為這一步缺乏經(jīng)驗導致的失誤而功虧一簣。而使用烘箱烘干5 min，可以得到大致相同的實驗結(jié)果。

4 總結(jié)

綜合上述實驗結(jié)果，在“觀察DNA 和RNA 在細胞中的分布” 實驗中， 使用0.1%～1%濃度的TritonX-100 代替8%鹽酸，透膜5 min，能起到增加細胞膜通透性、使染料著色更容易的效果，并且對于植物細胞和動物細胞都有較好的效果。

若不解離直接染色，亦能達到一定的效果，只是胞質(zhì)一般著色較淺。對于洋蔥內(nèi)表皮細胞樣本，染色前滴一小滴PBS 緩沖液可使樣本貼緊載玻片，不易折疊，便于染色；對于人類口腔上皮細胞，筆者認為其他研究者所報道過的直接涂片的效果較好，省去了烘干或烤干的過程，如使用透膜劑或鹽酸解離，烘箱烘干的效果好于酒精燈烤干。

關(guān)于Triton X-100 的安全性問題， 其性質(zhì)穩(wěn)定，如接觸黏膜、皮膚后，有一定的刺激性，但在正常的較低濃度的使用環(huán)境中， 還沒有報道對人體健康有重大不良影響， 并且因其廣泛應用于洗滌劑、個人護理用品、紡織加工等領(lǐng)域，可以成為中學教學中代替鹽酸的解離劑。如有條件，學生在實驗過程中佩戴一次性乳膠手套和口罩， 安全性有保障。