章熙東 段志鵬

（南京外國(guó)語(yǔ)學(xué)校 江蘇南京 210008）

“學(xué)始于問(wèn)，才能終究成為學(xué)問(wèn)?！惫夂献饔米鳛榈厍蛏献钣幸饬x的合成代謝， 在高中生物學(xué)必修1 模塊中占據(jù)重要地位， 是教師和學(xué)生公認(rèn)的重、 難點(diǎn)， 可挖掘的素材多。 在該模塊學(xué)習(xí)過(guò)程中，學(xué)生已不滿足于“秋天葉片變黃是因?yàn)槿~綠素容易受低溫破壞”的問(wèn)題解答，也不滿足于“葉綠素作為天然色素不宜添加在酸性食品中”的答案呈現(xiàn)（2012 江蘇小高考題目），學(xué)生更注重“低溫和pH 值是如何影響葉綠素含量， 進(jìn)而影響光合活性”的深度學(xué)習(xí)和過(guò)程體驗(yàn)，用問(wèn)題喚醒問(wèn)題。

STEM 教育目標(biāo)是整合各領(lǐng)域知識(shí)、 技能，將知識(shí)的學(xué)習(xí)與師生生活實(shí)踐結(jié)合起來(lái)， 通過(guò)科學(xué)探究的實(shí)踐解決現(xiàn)實(shí)生活的實(shí)際問(wèn)題， 培養(yǎng)創(chuàng)新型人才。 《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)》明確指出生物科學(xué)教育的核心任務(wù)就是培養(yǎng)學(xué)生必備的、可持續(xù)發(fā)展的生物科學(xué)素養(yǎng)， 將STEM 整合到教學(xué)實(shí)踐中，通過(guò)探究類學(xué)習(xí)，加深學(xué)生對(duì)生物學(xué)概念的理解，提升應(yīng)用知識(shí)的能力。因而在筆者在所開(kāi)設(shè)的《STEM 生物創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)》選修課上，帶領(lǐng)學(xué)生通過(guò)研究不同pH 和低溫脅迫對(duì)微囊藻葉綠素a含量及光合活性的影響， 探討藍(lán)藻對(duì)不同脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)及其生理機(jī)制，符合新課改理念，培養(yǎng)了學(xué)生的核心素養(yǎng)。

1 實(shí)驗(yàn)背景

光合作用是植物（包括藻類）最基本的生命活動(dòng)，將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能，并以有機(jī)物形式儲(chǔ)存。葉綠素在光合作用中起到吸收、傳遞、轉(zhuǎn)化光能的作用，葉綠素的含量與植物的光合速率密切相關(guān)，反映植物生長(zhǎng)狀態(tài)。 干旱、低溫、元素缺乏等外界因素都可以通過(guò)影響葉綠素的含量影響光合速率。 因此脅迫條件下的葉綠素含量測(cè)定對(duì)植物的光合生理與逆境生理具有重要意義。

光合活性表征的是藻細(xì)胞光合系統(tǒng)在一定條件下的狀態(tài)，受到科學(xué)家普遍關(guān)注。 葉綠素?zé)晒?，作為光合作用研究的探針?包含了許多光合信息，幾乎所有光合作用過(guò)程的變化均可通過(guò)葉綠素?zé)晒夥从场?藻類細(xì)胞的光合活性通?？捎萌~綠素?zé)晒獗碚黧w現(xiàn)，經(jīng)過(guò)暗適應(yīng)的藻細(xì)胞在低強(qiáng)度測(cè)量光條件下會(huì)發(fā)出初始熒光F0，經(jīng)過(guò)飽和脈沖高光強(qiáng)后發(fā)出最大熒光Fm和Fv（最大可變熒光）。Fv/Fm表征的是暗適應(yīng)下PSⅡ（光系統(tǒng)Ⅱ）反應(yīng)中心完全開(kāi)放時(shí)的最大光合速率。 在非脅迫條件下，此參數(shù)變化很小，但在脅迫條件下，此參數(shù)變化較大，反映PSⅡ內(nèi)在機(jī)制的變化。 Fv/Fm常作為表達(dá)藻類光合活性是否受損的敏感性指標(biāo)。 通常當(dāng)藻類受到脅迫時(shí)，葉綠體中的光系統(tǒng)Ⅱ是首先而且也是主要損害的部位。 熒光測(cè)定技術(shù)不需破碎細(xì)胞，不傷害生物體，因此通過(guò)研究葉綠素?zé)晒忾g接研究光合作用的變化是一種簡(jiǎn)便、 快捷、可靠的方法。

2 材料與方法

2.1 藻種選擇 銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是藍(lán)藻水華的主要藻種，喜溫（25°C 左右）喜堿（pH 值為10 左右）環(huán)境，易聚集成團(tuán)，對(duì)環(huán)境危害大。 實(shí)驗(yàn)用藻種購(gòu)自武漢水生所的淡水藻種庫(kù)（FACHB-469）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法 用0.1 mol/L 的HCl 和0.1 mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)藻液的pH，將pH 值調(diào)整為3、6、12后靜置30 min，低溫組將藻液放置于4℃處理30 min，同時(shí)設(shè)置不處理組為對(duì)照組。 每組設(shè)置3個(gè)平行。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

1）葉綠素a 含量測(cè)定。將5 mL 藻液經(jīng)玻璃纖維濾膜抽濾， 取出帶有浮游藻類的濾膜后裝入具塞玻璃試管中，加入5 mL 95%乙醇溶液，加塞后在4℃下浸提24 h。 將提取后的液體轉(zhuǎn)入離心管中6 000 g 的離心速度下離心15 min， 收集上清液，將上清液在分光光度計(jì)上，用10 mm 光程的比色皿，分別讀取664 nm、648 nm 波長(zhǎng)處的吸光值，并以95%乙醇作為空白吸光度測(cè)定，對(duì)樣品吸光度進(jìn)行校正。

2）葉綠素a 含量計(jì)算。 葉綠素a 含量按如下公式計(jì)算［1］：Chla（μg／mL）＝13.36A664-5.19A648

3）光合活性測(cè)定。 取2 mL 藻液，暗適應(yīng)20 min，采用葉綠素?zé)晒鈨x（AquaPen-C AP-C100）測(cè)定藻細(xì)胞葉綠素a 熒光， 測(cè)得參數(shù)最大熒光（Fm）、最小熒光（F0）、可變熒光強(qiáng)度Fv（Fm-F0）、PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/F0）、PSⅡ的潛在活性（Fv/Fm）。

3 結(jié)果與分析

3.1 低溫對(duì)葉綠素a 含量的影響 圖1結(jié)果顯示， 對(duì)照組葉綠素含量為4.48 μg/mL， 低溫組為4.05 μg/mL，低溫處理可以減少藻細(xì)胞的葉綠素a含量，但降低的幅度較小。低溫可以抑制葉綠素合成有關(guān)酶的活性，從而影響葉綠素的生物合成；低溫可能改變?nèi)~綠體的超微結(jié)構(gòu)， 打破了葉綠素酶與其底物葉綠素在空間位置上的隔離從而促進(jìn)了葉綠素的分解； 也可能通過(guò)影響某些同工酶的活性來(lái)影響葉綠素的合成和降解。此外，也可能是由于低溫的誘導(dǎo)，使藻體中產(chǎn)生了一些新的蛋白質(zhì)，這些新的蛋白質(zhì)保持了脫鎂螯合酶的活性從而促進(jìn)了葉綠素的分解［2］。

圖1 低溫處理下葉綠素α 濃度變化

3.2 pH 對(duì)葉綠素a 含量的影響 通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，不同的pH 處理造成了葉綠素a 含量不同程度降低（圖2），當(dāng)pH 為12 和6 時(shí)，葉綠素含量為4.29 和4.13 μg/mL；pH 為3 時(shí)葉綠素含量為0.20 μg/mL，此時(shí)藻體合成葉綠素受到明顯破壞。 藻類的葉綠素和其他生命物質(zhì)一樣，需經(jīng)歷合成和分解，在此過(guò)程中，藻細(xì)胞所處的環(huán)境對(duì)其是有影響的，例如光照等條件適應(yīng)會(huì)促進(jìn)合成， 反之則促進(jìn)其分解［3］。葉綠素的生物合成過(guò)程中，絕大部分都需要酶的參與，pH 可能會(huì)影響到這些酶的活力， 從而影響葉綠素的含量。 pH 脅迫導(dǎo)致葉綠素含量的降低，從而降低了藻細(xì)胞捕捉和利用光能的能力，同時(shí)也影響了光能在葉綠體中的分配。

圖2 不同pH 下葉綠素a 濃度變化（對(duì)照組為pH＝10）

3.3 低溫對(duì)藻類光合活性的影響 Fv/F0和Fv/Fm分別反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)原初光能轉(zhuǎn)化效率和PSⅡ潛在的光化學(xué)活性。 當(dāng)藻類暴露在環(huán)境壓力下時(shí)，F(xiàn)v/Fm值降低，即表明有光抑制現(xiàn)象或環(huán)境壓力使PSⅡ反應(yīng)中心部分或全部受損， 抑制了光合作用的原初反應(yīng)，阻礙了光合電子傳遞過(guò)程。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PSII 活性的抑制可以從快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線和熒光參數(shù)看出（圖3、圖4）。結(jié)果表明，低溫脅迫下，藻細(xì)胞的Fv/Fm和Fv/F0值明顯降低（比對(duì)照組分別降低了16.0%和23.8%），反映出PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)換效率和潛在活性減弱。 說(shuō)明低溫脅迫使藻類光系統(tǒng)PSⅡ活性中心受損，溫度脅迫還可以使光合電子傳遞過(guò)程受抑制， 光合電子傳遞速率下降。

圖3 低溫處理下的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)（OJIP）曲線

圖4 低溫處理下熒光參數(shù)變化（對(duì)照組為20℃）

3.4 pH 對(duì)藻類光合活性的影響 如圖5所示，熒光曲線的下降， 表明隨著pH 值的降低熒光產(chǎn)量顯著下降， 以及PSⅡ中QA、QB 和質(zhì)體醌之間電子傳遞受到了抑制。pH 對(duì)藻細(xì)胞熒光參數(shù)的影響如圖6所示。藻細(xì)胞的Fv/Fm和Fv/F0隨著pH 值的降低顯著下降， 說(shuō)明強(qiáng)酸條件使藻細(xì)胞光系統(tǒng)PSⅡ活性中心嚴(yán)重受損，光合活性顯著降低。

圖5 不同pH 下的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)（OJIP）曲線

4 結(jié)論

溫度和pH 值是影響酶活性的重要因素，進(jìn)而影響藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素含量和光合活性。

1）低溫對(duì)微囊藻葉綠素a 含量及光合活性造成了一定的影響，然而對(duì)其光合系統(tǒng)II 內(nèi)部的質(zhì)體醌和電子傳遞的影響不大。這表明，低溫對(duì)微囊藻細(xì)胞的影響可能主要表現(xiàn)為降低了細(xì)胞生陳代謝的整體速率， 從而導(dǎo)致其葉綠素a 合成速率的降低及光合活性的下降。

2）微囊藻耐堿性能力遠(yuǎn)強(qiáng)于耐酸性能力。 這些結(jié)果可能為控藻技術(shù)的發(fā)展提供參考依據(jù)。

5 實(shí)驗(yàn)反思

生物學(xué)新課程標(biāo)準(zhǔn)要求讓學(xué)生經(jīng)歷科學(xué)探究過(guò)程，習(xí)得科學(xué)研究方法，養(yǎng)成科學(xué)思維習(xí)慣，增強(qiáng)創(chuàng)新實(shí)踐能力， 基于STEM 理念的實(shí)驗(yàn)教學(xué)恰恰提供了這樣一個(gè)實(shí)踐平臺(tái)。 STEM 教育以設(shè)計(jì)和探索為手段，運(yùn)用科學(xué)與數(shù)學(xué)的思想，通過(guò)應(yīng)用技術(shù)手段，在解決實(shí)際問(wèn)題中進(jìn)行知識(shí)學(xué)習(xí)［4］。學(xué)生利用現(xiàn)有的多學(xué)科知識(shí)，在自主發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、嘗試解決問(wèn)題中進(jìn)行新知學(xué)習(xí)，構(gòu)建概念體系，發(fā)展科學(xué)素養(yǎng)，點(diǎn)燃了研究激情，完成了深度研究，喚起了新的問(wèn)題。 “重實(shí)踐”是新一輪課程改革所倡導(dǎo)的， 也是作為一線教師開(kāi)展課程建設(shè)與教學(xué)改革的著力點(diǎn)和方向。