楊 蕾，王燕霞，趙丕文，孫麗萍，饒晨晨，楊 陽(yáng)，張紅紅，陶仕英＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 北京 100050；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)院北京 100029；5.順義中醫(yī)醫(yī)院 北京 101300）

卵巢顆粒細(xì)胞（Ovarian granulosa cell，OG）是位于卵泡表面的多層壁細(xì)胞，顆粒細(xì)胞一方面能夠參與運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給卵母細(xì)胞，另一方面可以與卵泡內(nèi)膜細(xì)胞共同作用，分泌激素、生長(zhǎng)因子等多種物質(zhì)，調(diào)控卵母細(xì)胞的發(fā)育。卵巢功能下降會(huì)導(dǎo)致卵泡數(shù)目減少、卵子質(zhì)量下降[1]。卵巢儲(chǔ)備功能發(fā)生異常直接影響女性的生育能力，可引發(fā)不孕[2]。

順鉑（Cisplatin,CDDP）是目前臨床廣泛應(yīng)用于的化療藥物，作為細(xì)胞毒性藥物殺死腫瘤細(xì)胞。順鉑在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，可以破壞正常的卵巢顆粒細(xì)胞，產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性作用[3]。由順鉑引起的卵巢功能破壞已經(jīng)成為臨床常見且難治愈性婦科疾病，且發(fā)病率在近幾年呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)[4]。西醫(yī)治療主要是以雌、孕激素周期序貫療法為主，改善相關(guān)癥狀。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)則認(rèn)為卵巢功能發(fā)生異常主要是腎氣虧虛，精血不足所致，治當(dāng)以填精益髓，調(diào)理陰陽(yáng)，補(bǔ)益天癸[5]。二仙湯是張伯訥教授研制出來(lái)治療為絕經(jīng)期綜合癥的方子，主要具有溫腎益精、調(diào)理沖任、滋陰降火、平調(diào)陰陽(yáng)的作用[6]。在臨床治療卵巢功能異常中具有明顯的療效。

近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，本課題組前期也做了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。本課題組前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二仙湯具有調(diào)整生殖/內(nèi)分泌，保護(hù)卵巢的作用[7]。但是對(duì)其作用途徑和機(jī)理缺乏深入分析和探討。因此，本實(shí)驗(yàn)將探討二仙湯含藥血清通過AKT途徑介導(dǎo)順鉑所致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)用藥

二仙湯方劑組成包括：仙靈脾、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、仙茅、知母。按照《婦科臨床方劑學(xué)》規(guī)定的劑量比（9∶6∶10∶15∶12∶10）稱取，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供，根據(jù)東直門院提供的中藥顆粒與中藥飲片的固有比例進(jìn)行計(jì)算，最終按照人用藥劑量計(jì)算大鼠用藥劑量[7]為7.5*kg-1*d-1。注射用順鉑，每10 mg/支（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：611048CF）、戊酸雌二醇片1 mg/片（拜耳醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：195A5），均購(gòu)自東直門醫(yī)院。用法與劑量：成人每日1 mg，折算成大鼠所需劑量即0.009 mg·kg-1。

1.2 主要試劑

DMEM-F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，批號(hào)1300510、1403413）、孕馬血清促性腺激素（北京歐北有限公司，批號(hào)：hor-272）；特級(jí)胎牛血清（杭州四季青公司，批號(hào)：20160627）；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液、濃縮膠緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20160627、20160321、s1051、s1053），ECL超敏發(fā)光液（北京普利萊基因有限公司，批號(hào)：P1010），蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Marker（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：00246538）；二抗Anti-RabbitIgG/HRP和Anti-MouseI-gG/HRP（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：c1306c1340）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：M-MLV First Strand RT Kit、PCR酶：qPCR Master Mix（北京華英生物科技有限公司，目錄號(hào)：RT03、Catalog：DBI-2043）；P-AKT、AKT抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：sc30066sc20341），引物序列（表1）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

22-24 d健康雌性，SPF級(jí)，SD大鼠，共40只，體質(zhì)量（60±10）g。購(gòu)自（北京）斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，使用許可證：SCXK（京）2011-0004。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱（MCO-20AIC,SANYO）；

倒置顯微鏡（TS100,NIKON）；

低溫離心機(jī)（3K15,SIGMA）；

表1 引物序列

多功能熒光酶標(biāo)儀（SAFIRE2,TECAN）；

超凈工作臺(tái)（022-2522，此京亞泰隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心）；

鼓風(fēng)干燥箱（101FXB-2，上海樹立儀器儀表有限公司）；

壓力蒸汽消毒器（YX-280d,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；

離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司LG16-WA型）；

PCR擴(kuò)增儀（Long Gene公司MyGene MG96+型）；

2 方法

2.1 原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞提取及培養(yǎng)

22-24天雌性SD大鼠10只，體重35 g，飼養(yǎng)在23-25℃，光照12 h，食水隨意，適應(yīng)性喂養(yǎng)一天，注射孕馬血清促性腺激素50IU/只，48小時(shí)后，在無(wú)菌條件下取出雙側(cè)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。具體操作如下：

1）取SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)脫臼處死，浸泡75%酒精中消毒3分鐘；2）消毒后放入已消毒托盤中在超凈臺(tái)中取雙側(cè)卵巢，放入預(yù)冷的Hank′s液2.7 ml；3）用Hank′s液清洗三次，將其中的脂肪、包膜等清理干凈；4）將卵巢移入無(wú)血清培養(yǎng)基中，用1 ml一次性注射器刺破卵巢，5 min/只，使顆粒細(xì)胞充分釋放；5）加入0.3 ml 2.5%胰酶反復(fù)用吸管吹打懸液數(shù)次，使顆粒細(xì)胞團(tuán)塊分離。37%消化10 min（每3 min，震蕩或吹打一次）；6）加入1 ml含血清培養(yǎng)液終止消化，并靜置10 min。取懸液加入15 ml離心管中；7）1 000 rpm離心10 min，棄上清。加入生理鹽水5 ml沖散細(xì)胞再次離心；8）棄上清，加入10%胎牛血清0.2 ml，吹打均勻；9）計(jì)數(shù)：應(yīng)用血球小板計(jì)數(shù)，調(diào)整懸液濃度，以5*105接種于96孔板中。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察貼壁情況，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底至75%-80%融合時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 制備藥理血清

22-24天的雌性SD大鼠50只，體重35 g-40 g，飼養(yǎng)在23-25℃，光照12 h，食水隨意，適應(yīng)性喂養(yǎng)一天，第二天取藥理血清。具體操作如下：

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

藥理血清動(dòng)物分三組：（1）正常組：灌胃蒸餾水0.4 ml/天（2）陽(yáng)性對(duì)照組：灌胃補(bǔ)佳樂0.5 ml/天（3）二仙湯組：灌胃二仙湯0.4 ml/天，各組連續(xù)灌胃三天，于第四天晨起七點(diǎn)灌胃，兩個(gè)小時(shí)以后，心臟取血并分離血清，-20℃保存。

2.3 順鉑干預(yù)卵巢顆粒細(xì)胞

待細(xì)胞生長(zhǎng)至底壁的75%-80%時(shí)，將模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、二仙湯組的培養(yǎng)基吸出，每孔加入CDDP（濃度為2.5 ug/ml）200 ul，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

2.4 藥理血清處理

于CDDP作用12 h后，進(jìn)行給藥處理，每孔加入相應(yīng)的藥理血清組200 ul，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

2.5 TUNEL法檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡情況

1）收集細(xì)胞，胰酶消化然后離心，去上清液，留沉淀；2）加入4%多聚甲醛固定放在4℃冰箱保存2 d；玻片加入稀釋好的TdT和DIG-d-UTP，混勻；4）吸走切片上多余液體后將所有樣品統(tǒng)一放入濕盒中，37℃、2 h、0.01M TBS洗2 min，清洗3次；5）每片滴加封閉液50 μl，放置室溫下30 min，然后甩掉封閉液；6）用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體：混勻后滴加50 μl；7）將樣品放置于濕盒中，37℃反應(yīng)30 min。0.01 M TBS洗2 min，清洗3次；8）用抗體稀釋液1：100稀釋SABC：取1 ml抗體稀釋液加SABC 10μl，混勻后分別滴加50μl至每個(gè)標(biāo)本切片上；9）37℃反應(yīng)30 min；10）0.01 M TBS洗5 min，清洗4次；11）加SABC-FITC的標(biāo)本在熒光顯微鏡下調(diào)用藍(lán)色光激發(fā)并觀察、記錄；

2.6 蛋白印跡法（Western Blot）檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞中akt、p-akt蛋白表達(dá)量

1）蛋白提取；2）蛋白質(zhì)定量；3）SDS－PAGE電泳：配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠120 V），電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；4）電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜：采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，60 V，120 min；5）封閉：室溫下在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中于搖床上輕輕搖動(dòng)封閉1.5 h；6）一抗孵育：加一抗4℃過夜，用TBST在室溫下?lián)u床上洗三次，每次10 min。7）二抗孵育：加二抗室溫孵育1 h，用TBST在室溫下?lián)u床上洗三次，每次10 min。8）蛋白檢測(cè)：顯色加HRP-ECL超敏發(fā)光劑作用2-5 min，置于保鮮膜內(nèi)固定于暗盒中、。9）圖像的采集與分析將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

2.7 RT-PCR檢測(cè)各組卵巢顆粒細(xì)胞中akt基因表達(dá)量

2.7.1 提取各實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的RNA

1）將細(xì)胞全部收集，去掉上清后，加入400 ul RNA Lysis Buffer，并重懸細(xì)胞；

2）向上一步混合液中加入等體積的無(wú)水乙醇，并混勻；

3）將上述混合液過IIC柱；并12 000 rpm離心1 min；棄廢液；

4）向 IIC 中 加入 400 ul RNA Wash Buffer，并12 000 rpm離心1 min；

5）向IIC中加入40 ul預(yù)先配制的DnaseI Reaction Mix（5 ul DnaseI+40 ul DNA Digestion Buffer），室溫放置15 min，然后離心；

6）加 400 ulRNA Prep Buffer，并 12 000 rpm 離心1 min；

7）加700 ulRNA Wash Buffer，并12 000 rpm離心1 min；

8）加400 ulRNA Wash Buffer，并12 000 rpm離心3 min；

9）加入25 ul Dnase/Rnase-Free Water洗脫RNA。

2.7.2 RNA濃度測(cè)定

提取好的RNA，濃度測(cè)定結(jié)果如下：OD值符合要求。

2.7.3 反轉(zhuǎn)錄

反應(yīng)條件：42℃，60 min；70℃,10 min（表2）。

2.7.4 熒光定量PCR

待測(cè)基因和內(nèi)參基因每個(gè)樣品各做三個(gè)重復(fù)，并設(shè)陰性對(duì)照；

反應(yīng)體系（表3）及條件：

2.7.5 RT-PCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)

所測(cè)目的基因與內(nèi)參基因?qū)Ρ群?，用?shí)時(shí)熒光定量PCR的相對(duì)定量法2-ΔΔCT計(jì)算，代表AKT RNA的表達(dá)情況。ΔΔCT法計(jì)算的相對(duì)表達(dá)量的公式如下：

ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因

ΔΔCT=ΔCT檢驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組

相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT

3 結(jié)果

3.1 二仙湯含藥血清對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察

與正常組相比，模型組凋亡十分明顯。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組凋亡得到緩解，二仙湯組與模型組相比較凋亡情況也得到改善（圖1）；由此可看出二仙湯含藥血清能抑制順鉑干預(yù)后的卵巢顆粒細(xì)胞損傷。

表3 反應(yīng)體系

3.2 TUNEL法觀察二仙湯含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)影響

與正常組相比，模型組凋亡情況十分明顯。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組凋亡情況得到緩解，二仙湯組與模型組相比較凋亡情況也得到改善（圖2）；由此可看出二仙湯含藥血清能抑制順鉑干預(yù)后的卵巢顆粒細(xì)胞損傷。

3.3 蛋白印跡法檢測(cè)各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞akt、p-akt蛋白表達(dá)量的變化

圖1 觀察各組卵巢顆粒細(xì)胞情況

圖2 TUNEL法觀察各組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況

圖3 .1各組卵巢顆粒細(xì)胞akt蛋白的表達(dá)量的變化

圖3 .2各組卵巢顆粒細(xì)胞P-akt蛋白的表達(dá)量的變化

表4 各組卵巢細(xì)胞中akt、p-akt蛋白表達(dá)量分析結(jié)果（x±s，n=6）

圖4 各組卵巢顆粒細(xì)胞P-akt蛋白的表達(dá)量的變化

圖5 各組卵巢顆粒細(xì)胞akt蛋白的表達(dá)量的變化

圖6 各組卵巢顆粒細(xì)胞akt蛋白的表達(dá)量的變化

和正常組比較，akt、p-akt蛋白表達(dá)量總體趨勢(shì)走向、強(qiáng)度、結(jié)果相似。使用順鉑造模后的各實(shí)驗(yàn)組中的akt、p-akt蛋白表達(dá)量均減少，模型組akt、p-akt蛋白表達(dá)量最少，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；和模型組比較，各治療組均akt、p-akt蛋白表達(dá)量表達(dá)增多，但akt、p-akt蛋白表達(dá)量均低于正常組，其中二仙湯組akt、p-akt蛋白表達(dá)量略低于陽(yáng)性對(duì)照組akt、p-akt蛋白表達(dá)量，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

表5 各組卵巢細(xì)胞中akt基因表達(dá)量分析結(jié)果（x±s，n=6）

3.4 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞akt基因表達(dá)量的變化

和正常組比較，使用順鉑造模后的各實(shí)驗(yàn)組中的akt基因表達(dá)量均減少，模型組akt基因表達(dá)量最少，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；和模型組比較，各治療組akt基因表達(dá)量表達(dá)增多，但akt基因表達(dá)量均低于正常組，其中二仙湯組akt基因表達(dá)量略低于陽(yáng)性對(duì)照組akt基因表達(dá)量，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）

圖7 AKT基因擴(kuò)增曲線

圖8 AKT基因溶解曲線

4 討論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)探索到二仙湯能夠升高大鼠血清中激素水平，降低由順鉑所致的細(xì)胞凋亡[8]；明確二仙湯能夠提高各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中bcl-2蛋白的表達(dá)，降低各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中bax蛋白的表達(dá)；考慮二仙湯可能通過改善激素水平，抑制卵巢儲(chǔ)蓄功能破壞，通過調(diào)控凋亡調(diào)控蛋白，最終起到改善卵巢功能的作用[9]。為了進(jìn)一步了解二仙湯經(jīng)pI3k/akt信號(hào)通路在臨床治療中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過選取22-24 d大鼠原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞并用順鉑造模的方法建立大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的模型，經(jīng)補(bǔ)佳樂及二仙湯含藥血清干預(yù)。運(yùn)用分子生物學(xué)方法研究各實(shí)驗(yàn)組AKT的表達(dá)及變化。探討二仙湯含藥血清通過AKT途徑介導(dǎo)順鉑所致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制。

本次實(shí)驗(yàn)采用TUNEL檢測(cè)技術(shù)觀察各組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組凋亡率明顯增加。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組凋亡情況及二仙湯組凋亡情況均有改善。提示二仙湯可以有效地降低順鉑損傷后的卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。蛋白印跡法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組akt、p-akt蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示：和正常組比較，順鉑造模后的各實(shí)驗(yàn)組中的akt、p-akt蛋白表達(dá)量均減少，模型組akt、p-akt蛋白表達(dá)量最少，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；和模型組比較，各治療組均akt、p-akt蛋白表達(dá)量表達(dá)增多，但akt、p-akt蛋白表達(dá)量均低于正常組，其中二仙湯組akt、p-akt蛋白表達(dá)量略低于陽(yáng)性對(duì)照組，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示二仙湯含藥血清可以抑制順鉑損傷的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，考慮可能是因?yàn)槎蓽赡芡ㄟ^AKT途徑提高akt、p-akt的表達(dá)，影響下游靶蛋白，最終起到保護(hù)卵巢的作用。RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組akt基因表達(dá)水平與蛋白印跡表達(dá)相一致。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是與細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞増殖關(guān)系非常密切的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，其主要作用有（1）誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1的表達(dá)和活性；（2）是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與多個(gè)蛋白或激酶參與細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)；（3）參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、增殖、調(diào)亡、血管生成、自噬等過程中，發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能[10]。AKT又稱PKB，是PI3K下游一種主要的效應(yīng)蛋白，其在PI3K/AKT/mTOR這一個(gè)信號(hào)通路中處于中心環(huán)節(jié)。在正常的生理狀態(tài)下，活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的異常激活過程中，AKT通過直接磷酸化下游靶蛋白mTOR，而活化后的mTOR進(jìn)一步磷酸化激活其下游的靶分子，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展[11]。AKT被磷酸化之后可通過進(jìn)一步誘導(dǎo)Bax/Bcl-2、Caspase3/8/9和FOX家族磷酸化，并抑制它們的活化，通過這樣來(lái)起到抑制細(xì)胞調(diào)亡的作用；AKT可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤壞死因子以及環(huán)氧化酶-2誘導(dǎo)的血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞遷移[12]。

二仙湯可以有效地降低經(jīng)順鉑損傷后的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，保護(hù)顆粒細(xì)胞，能夠減緩卵巢儲(chǔ)備功能下降，起到很好的治療效果。考慮可能是因?yàn)槎蓽ㄟ^AKT途徑提高akt、p-akt的表達(dá)，影響下游靶蛋白，通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路而達(dá)到保護(hù)卵巢的作用。