馬麗娜，馬 青，李穎康

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高以及對(duì)心血管疾病的高度關(guān)注，高脂肉類逐漸受到冷落，脂尾（臀）型綿羊品種也越來越不受消費(fèi)者歡迎。此外，過多的尾脂沉積隨著養(yǎng)殖設(shè)施的不斷改善對(duì)綿羊已無太大意義，而且還會(huì)增加飼養(yǎng)成本，因此，低脂型肉羊品種將成為今后的培育方向。研究綿羊尾部脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而減少多余的尾部脂肪沉積，對(duì)于低脂肉用綿羊品種的培育具有重要的理論價(jià)值與實(shí)際意義。灘羊是寧夏回族自治區(qū)的特色畜種之一，灘羊肉也是羊肉中的精品，其肉質(zhì)細(xì)嫩、脂肪分布均勻、無膻味，深受消費(fèi)者歡迎。但是由于灘羊?qū)儆陂L(zhǎng)脂尾，尾脂重，不能被利用，影響了該品種的進(jìn)一步開發(fā)利用，因此，培育尾脂小的灘羊品系，提升該品種生產(chǎn)性能水平，是當(dāng)前急需解決的問題。為此，筆者對(duì)前期研究中利用基因芯片掃描和選擇信號(hào)檢測(cè)篩選得到的灘羊尾脂組織中與脂肪合成代謝相關(guān)的 6個(gè)重要候選基因（PDGFD、CAV1、PPARG、HSL、PLA2G16、RETN） 進(jìn)行 mRNA 表達(dá)量研究，以期為進(jìn)一步闡明灘羊尾部脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制，以及灘羊尾型選育和品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與前處理

采集灘羊尾脂組織24份，浸泡在RNAlater中，置于-70℃保存。提取RNA后用于候選基因相對(duì)表達(dá)量分析。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

參照GenBank公布的綿羊6個(gè)候選基因（PDGFD、CAV1、PPARG、HSL、PLA2G16、RETN）序列和18S rRNA基因序列，采用Primer Premier 5.0在其保守區(qū)域各設(shè)計(jì)1對(duì)引物。各候選基因及內(nèi)參基因的引物序列及預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 灘羊尾脂樣本總RNA提取

用Trizol法提取組織樣本中的總RNA。操作步驟如下：用研缽研磨組織樣品，放入加有1 mLTrizol的離心管中靜置5～10 min；加入0.2 mL氯仿上下劇烈混勻15～30 s，然后靜置3 min（冰浴或室溫）；4℃、12 000 r/min離心 15 min；取水相到新的EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻，冰浴10 min；4℃、12 000 r/min離心 10 min；傾倒上層液體，用1 mL 75%冰乙醇沉淀，混勻；4℃、12 000 r/min離心10 min；干燥。加入DEPC處理水溶解RNA，測(cè)定濃度，-80℃保存。

表1 候選基因及內(nèi)參基因引物序列

1.4 RNA電泳

取5 μL提取的總RNA樣本，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。

1.5 反轉(zhuǎn)錄

利用TIANScript RT Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，步驟如下：向反應(yīng)管中加入50 μL 反應(yīng)體系的第一部分，包括：總 RNA 1 μL、Oligo （dT）（18S rRNA 用隨機(jī)引物）2 μL、Super-Pured NTP 2 μL， 用 RNase-Free ddH2O 定容至14.5 μL，混勻。 70℃加熱 5 min，迅速在冰上冷卻2 min，簡(jiǎn)短離心。收集反應(yīng)液后加入以下各組分：上述混合液 14.5 μL、5×First-Strand Buffer 0.5 μL、RNasin 0.5 μL、TIANScrip M-MLV 1 μL，輕輕吸打混勻，25℃溫浴 10 min，42℃溫浴 50 min，95℃加熱5 min。用RNase-Free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到 50 μL，-20℃保存。

1.6 Real-time PCR檢測(cè)

1.6.1 Real-time PCR反應(yīng)體系及程序：采用20 μL反應(yīng)體系，包括：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.6 μL，下游引物（10 μmol/L）0.6 μL，cDNA 100 ng，50×ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，加入滅菌純化水至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，15 min；（95 ℃，15 s，58 ℃，30 s，72 ℃，30 s）×45個(gè)循環(huán)。

1.6.2 樣品Real-time PCR檢測(cè)：將各樣品cDNA10倍稀釋后取2 μL作為模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)，在60～95℃進(jìn)行熔解曲線分析，每個(gè)樣品cDNA重復(fù)檢測(cè)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品RNA提取質(zhì)量

取5 μL提取的RNA樣品，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。由圖1可知，電泳獲得28 S、18 S和5 S共3條清晰的條帶，表明RNA無明顯降解。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，樣本的OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0，表明提取的 RNA純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 各候選基因Real-time PCR檢測(cè)

內(nèi)參基因及各候選基因的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物熔解曲線見圖2～圖8。

2.3 各基因mRNA相對(duì)定量分析

由表 2 可以看出，6 個(gè)基因（PDGFD、CAV1、PPARG、HSL、PLA2G16、RETN） 在灘羊尾脂組織均有表達(dá)，其中HSL基因的mRNA表達(dá)量顯著高于其他基因（P＜0.05）。

表2 6個(gè)候選基因的mRNA在尾脂中的相對(duì)定量結(jié)果

圖2 內(nèi)參基因（18S rRNA基因）實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物熔解曲線

圖3 CAV1基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物熔解曲線

圖4 P DGFD基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物熔解曲線

圖5 PLA2G16基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物熔解曲線

3 討論

脂肪組織的生長(zhǎng)分為脂肪細(xì)胞的增殖 （體積的增大）和分化（數(shù)量的增加）兩方面，其是由多種基因參與調(diào)控的復(fù)雜過程，其中，PPARG基因起著不可替代的作用。脂尾型綿羊從出生開始就在尾部?jī)?chǔ)存大量脂肪，尾部脂肪占全身脂肪的很大部分。近年來，人們對(duì)羊肉的消費(fèi)觀念發(fā)生了改變，大脂尾羊的優(yōu)勢(shì)逐漸減小，生產(chǎn)者越來越傾向于通過增加整體經(jīng)濟(jì)效益來降低成本，而體脂和尾脂的過度沉積會(huì)影響羊只出售，因此，尾脂尺寸的減小是當(dāng)前階段肉羊選種育種的主要方向之一。

圖6 P PARG基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物熔解曲線

圖7 RETN基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物熔解曲線

圖8 HSL基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物熔解曲線

抵抗素（resistin，RETN）、小凹蛋白 1（caveolin-1，CAV1）、脂肪特異性磷脂酶 A2（adiposespecific phospholipase A2，PLA2G16） 是脂肪細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子，在細(xì)胞分化、增殖等方面發(fā)揮重要的作用［1］。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，RETN、CAV1、PLA2G16均參與脂肪的代謝、分化過程，為了進(jìn)一步證實(shí)上述3個(gè)因子對(duì)綿羊的尾脂沉積與代謝性狀的影響，有研究采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)了 RETN、CAV1、PLA2G16基因在灘羊尾脂組織中的表達(dá)［2-3］。灘羊是長(zhǎng)脂尾型綿羊，其獨(dú)特的尾脂在維持機(jī)體正常的新陳代謝和體溫過程中扮演了重要的角色，但截至目前國內(nèi)外有關(guān)尾脂沉積與代謝調(diào)控機(jī)制的報(bào)道較少。近年來，有國外學(xué)者提出 RETN、CAV1和 PLA2G16基因可能參與了脂肪沉積與代謝生物學(xué)過程［4］，因此，研究 RETN、CAV1和 PLA2G16基因在灘羊尾脂沉積調(diào)控中的作用及機(jī)制，對(duì)揭示灘羊尾脂沉積與代謝的具體機(jī)制有重要的科學(xué)意義。PDGFD是PDGF 4個(gè)家族成員中促進(jìn)增殖作用最強(qiáng)的一個(gè)，它最早是在人類血小板中被檢測(cè)并純化出來的，其隱藏在α顆粒中并釋放出來，對(duì)血小板起到激活作用。PPARG能夠調(diào)控脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)分化過程。PPARG在蛋白質(zhì)、葡萄糖及脂質(zhì)的代謝過程中也具有重要調(diào)控作用，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和生長(zhǎng)發(fā)育過程中部分相關(guān)基因的表達(dá)。林婄婄等［5］對(duì)不同脂尾型綿羊脂肪組織中的PPARG基因發(fā)育性表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，PPARG基因的表達(dá)在品種間存在差異，廣靈大尾羊（長(zhǎng)脂尾型）尾脂組織中PPARG基因的表達(dá)量高于小尾寒羊（短脂尾型），且月齡對(duì)PPARG基因的表達(dá)無顯著影響。劉真等［6-7］基于蒙古羊（短脂尾型）和藏羊 （瘦尾型）群體的 Illumina Ovine SNP 50K芯片分型數(shù)據(jù)，采用FST法有效檢測(cè)到受選擇的基因，其中，部分基因與綿羊重要性狀相關(guān)，并通過相對(duì)定量試驗(yàn)證明PPARG基因和PDGFD基因與尾部脂肪沉積密切相關(guān)，可以作為尾型選育的候選基因。欒兆進(jìn)等［8］研究發(fā)現(xiàn)，激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）基因（HSL）對(duì)肌內(nèi)脂肪的沉積可能具有抑制作用。