趙 燕，張 新，張 劍，田石琦，常英霞

(1.河北醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050081；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江 佳木斯 154002)

青光眼是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲眼病，嚴重威脅著人眼的視力健康，眼內(nèi)壓力呈現(xiàn)間斷性或者持續(xù)性升高是其發(fā)病過程中的主要因素[1-2]。研究[3-4]表明：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡是導致青光眼的發(fā)病機制之一。因此，通過藥物有效抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡是治療青光眼的一個重要靶點。杞菊地黃丸具有滋補肝腎、益精養(yǎng)血明目的功效。研究[5]表明：玄府閉塞和精血不足是導致青光眼視神經(jīng)損害的主要病機，以開通玄府和益氣活血的方法作為青光眼視神經(jīng)保護的首要治則。目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)杞菊地黃丸對視網(wǎng)膜神經(jīng)保護機制研究的報道，因此，本研究通過觀察杞菊地黃丸對高眼壓大鼠模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)及含胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3) mRNA和蛋白表達的影響，探討杞菊地黃丸對青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)的保護作用及其相關(guān)機制，旨在為研究杞菊地黃丸對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞損傷的保護作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 雌性SD大鼠50只，10～12周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物學部，動物合格證號：SYXK(冀)2013-0023。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度22℃～25℃，相對濕度55%～72%。杞菊地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)，山羊抗大鼠Bcl-2、山羊抗大鼠Bax和兔抗大鼠caspase-3(美國Santa Cruz公司)。Tonolab動物眼壓計(芬蘭愛科公司)，HM 355S石蠟切片機(美國賽默飛世爾科技有限公司)，DS-Ri2顯微成像系統(tǒng)(日本尼康公司)，ABI Veriti96 PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Powerpac Univeal電泳儀和VersaDoc凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

1.2 青光眼大鼠模型制備和實驗動物分組 50只SD大鼠隨機分為空白對照組，模型組，低、中和高劑量杞菊地黃丸組；除空白對照組外，其余各組大鼠采用烙閉上鞏膜靜脈法進行單眼造模[6]。以10%水合氯醛(0. 4 mL·100 g-1)腹腔注射，麻醉，將奧布卡因滴眼液(4 g·L-1)滴入雙眼結(jié)膜囊內(nèi)，使雙眼表面麻醉。以右眼為對照眼，左眼為實驗眼，將大鼠頭部置于裂隙燈顯微鏡頭架處，用532二極管激光行左眼270°角膜緣血管網(wǎng)和角膜緣顳上、顳下3條淺層鞏膜靜脈血管光凝，雙眼滴入諾氟沙星滴眼液，隔日在裂隙燈顯微鏡下觀察結(jié)膜的充血情況以及角膜水腫情況，測量雙眼的眼壓，若左眼眼壓高于右眼眼壓10 mmHg表示造模成功。藥物劑量按成人給藥劑量采用體表面積換算，低、中和高劑量杞菊地黃丸組分別灌胃給予劑量為1、2和4 g·kg-1的杞菊地黃丸，空白對照組和模型組大鼠分別口服給予等體積生理鹽水，每天1次。

1.3 大鼠眼壓檢測 于給藥12周后，以0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，采用眼壓計檢測眼壓，連續(xù)檢測3次取平均值。

1.4 組織切片制備和HE染色 于給藥12周后處死大鼠，立即摘除眼球(含球后視神經(jīng)2 mm)，角膜貫穿一小切口, 于15%甲醛組織固定液中浸泡24 h，沿視神經(jīng)連線對剖眼球，去除眼前節(jié)和玻璃體，梯度脫水、透明、石蠟包埋，切片(4 μm)。蒸餾水洗滌，采用蘇木素染色10 min，沖洗后，于10 g·L-1鹽酸乙醇分化30 s，于蒸餾水中浸泡15 min，伊紅復(fù)染5 min，采用不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯洗滌1 min，中性樹脂封固，顯微鏡下觀察眼球組織形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 TUNEL法檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡指數(shù) 分離視網(wǎng)膜在內(nèi)的后半部分眼杯，于15%甲醛組織固定液中浸泡，4℃固定24 h，梯度脫水、透明、包埋、切片。采用40 g·L-1多聚甲醛/免疫染色固定溶液染色15 min，滴入20 mg·L-1蛋白酶K工作液，室溫孵育10 min，40 g·L-1多聚甲醛固定5 min，100 μL平衡液8 min，滴加反應(yīng)液并于濕盒中孵育1 h，37℃，避光，終止反應(yīng)，KPBS洗滌，滴入DAPI染液，孵育15 min，封片。于光學顯微鏡下，每張切片隨機選取6個視野，觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡情況，正常視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕褐色，分別計數(shù)每個視野中陽性著色細胞數(shù)，計算出視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡指數(shù)，取平均值。凋亡指數(shù)計算公式：凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 RT-PCR法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達水平 取各組大鼠視網(wǎng)膜組織，按照Trizol說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用PCR儀進行擴增，所用引物序列：Bcl-2，上游引物5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，下游引物5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′；Bax，上游引物5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，下游引物5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′； caspase-3，上游引物5′-TGGAGAGAAGATGGTTTGAGC-3′，下游引物5′-CCCTATTGCTGGATGCTTTC-3′；GAPD，上游引物5′-GATGCTGGTGCTGAGTATGCCG-3′，下游引物5′-GTGGTGCAGGATGC-3′。擴增條件：92℃、30 s，65℃、30 s，72℃、54 s，共 32個循環(huán)；74℃延伸3 min。所得結(jié)果直接在熒光定量操作系統(tǒng)中進行比較分析，分別以Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA條帶與GAPD條帶的灰度比值表示mRNA表達水平，測定平均值。

1.7 免疫組織化學法檢測大鼠視網(wǎng)組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平 取大鼠視網(wǎng)膜組織切片，采用免疫組織化學法染色，使用Motic圖像系統(tǒng)進行圖像處理，每張切片取 4個視野，每個視野面積為0.2 mm×0.2 mm。測定吸光度(A)值，對陽性染色細胞予以半定量分析，以A值表示視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠眼壓 與空白對照組比較，模型組大鼠眼壓明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠眼壓明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠眼壓

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with model group.

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)表現(xiàn) 空白對照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維排列整齊，神經(jīng)節(jié)細胞間隙清楚。模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維排列不整齊，纖維間質(zhì)水腫，細胞層呈空泡樣，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目明顯減少。低劑量杞菊地黃丸組大鼠視神經(jīng)纖維排列不整齊，纖維間質(zhì)部分水腫，偶見空泡。中劑量杞菊地黃丸組大鼠細胞形態(tài)大致正常。高劑量杞菊地黃丸組大鼠眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目多于模型組。低和中劑量杞菊地黃丸組大鼠眼視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維細胞排列整齊，神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)正常。見圖1(插頁三)。

2.3 各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡指數(shù) 與空白對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡指數(shù)明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)。見表2和圖2(插頁三)。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達水平 與空白對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 mRNA、Bax和caspase-3 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，Bax和caspase-3 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖3和表3。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡指數(shù)

Tab.2 Apoptotic indexes of retinal ganglion cells in various groups (n=10,±s,η/%)

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with model group.

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平 與空白對照組比較，模型組大鼠Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Bax和caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖4(插頁四)和表4。

Lane 1:Blank control group; Lane 2: Model group; Lane 3-5: Low, medium, and high doses of Qijudihuang Pill groups.

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 mRNA in retina tissue of rats in various groups

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達水平

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with model group.

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with model group.

3 討 論

研究[7]認為：青光眼屬五風內(nèi)障，五風內(nèi)障主要由于玄府閉塞、經(jīng)脈不利、珠內(nèi)氣血津液不行和神水瘀積所致。臨床上主要通過滋養(yǎng)肝腎、活血化瘀的方法作為中醫(yī)的基本治則防治青光眼視神經(jīng)損害[8-9]。杞菊地黃丸由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉組成，方中熟地黃補血養(yǎng)陰、填精益髓；山茱萸補益肝腎、斂陰；澤瀉利水滲濕，泄熱，兼防熟地滋膩；茯苓健脾利水；牡丹皮，清熱涼血、活血祛瘀。以上6種中藥共同配伍，起補肝腎活性的作用。菊花清熱解毒，清疏上焦頭目風熱，利于滋養(yǎng)陰精；枸杞子滋補肝腎、益精明目。菊花、枸杞子二者均入肝經(jīng)，具有滋陰養(yǎng)肝、明目的功效。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞是構(gòu)成視網(wǎng)膜神經(jīng)元的主要細胞，青光眼的發(fā)生常伴隨視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，該過程不可逆，其凋亡程度通常作為治療青光眼藥物療效的評價指標[10-12]。機體細胞凋亡過程受到Bcl-2、Bax和caspase-3等多種基因調(diào)控[13]。Bcl-2可抑制細胞凋亡，Bax是凋亡促進基因，二者在細胞凋亡調(diào)控過程中是相互對立的一對調(diào)控基因[13-15]。caspase-3是凋亡途徑的共同下游部分，直接促使細胞凋亡[16-17]。Bcl-2和Bax為caspase-3的上游調(diào)控機制，Bcl-2和Bax的表達能調(diào)節(jié)外環(huán)境誘發(fā)的caspase-3的激活和調(diào)亡；caspase-3亦可作為Bcl-2和Bax的上游調(diào)控機制。近年來研究[18-20]顯示：Bcl-2、Bax可作為caspase-3的直接底物而作用于caspase-3的下游，加速凋亡的發(fā)生。

本研究組織病理學結(jié)果表明：模型組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不完整，神經(jīng)纖維排列不整齊，纖維間質(zhì)水腫且可見空泡，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠視網(wǎng)膜組織神經(jīng)均得到不同程度改善，說明杞菊地黃丸可以減輕青光眼視網(wǎng)膜損傷；TUNEL檢測結(jié)果表明：杞菊地黃丸可有效減少青光眼模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡；此外，模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平有所升高，Bax和caspase-3 mRNA及蛋白表達水平明顯提高。本研究結(jié)果表明：杞菊地黃丸可通過抑制網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，調(diào)控Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA及蛋白的表達水平，對青光眼大鼠的視網(wǎng)膜起保護作用。