袁虎勤，李 強

(1.甘肅省腫瘤醫(yī)院腸胃外科，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學第一醫(yī)院腸胃外科，甘肅 蘭州 730000)

胃癌的發(fā)生率呈逐年上升的趨勢，患者死亡率高，在我國高發(fā)性消化系腫瘤中占第1位，且就診患者多數(shù)已進入晚期。誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌藥物治療腫瘤的重要機制之一。對于胃癌患者，目前臨床治療仍以化療為主，但不良反應大，療效差，故開發(fā)新藥以提高療效及減輕患者痛苦尤為重要。水飛薊素是一種黃酮木脂素類化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降血脂和神經(jīng)保護等作用，其發(fā)揮主要活性作用的是水飛薊素及其復合物[1]。水飛薊素主要作用于細胞增殖旺盛的組織或器官，其抗癌機制呈現(xiàn)多靶點、多步驟和全方位等特點，因此在腫瘤治療中展現(xiàn)了潛在的應用價值[2]。國內(nèi)外相關研究[3-4]表明：水飛薊素可明顯抑制某些腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞分化以及抑制腫瘤血管生成等。Chen等[5]發(fā)現(xiàn)：水飛薊素能抑制乳腺癌細胞的增殖和DNA合成。劉志剛等[6]研究證明：水飛薊素可抑制人膀胱癌細胞增殖，使細胞周期阻滯在G1期。Cheung等[7]研究顯示：水飛薊素具有抑制肺癌SHP-77細胞的生長及加速細胞凋亡的作用。然而，水飛薊素對人胃癌細胞的影響及機制尚不清楚。本研究以不同濃度水飛薊素干預人胃癌SGC 7901細胞，初步探討水飛薊素對細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制，為其臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 人胃癌SGC 7901細胞(中國醫(yī)科大學細胞生物教研室)。水飛薊素(西安小草植物科技有限責任公司)，RPMI 1640 培養(yǎng)基和胰蛋白酶(美國Hycone公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，二甲基亞砜(美國Sigma公司)， 2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(百奧生物公司)。Transwell 小室(中國Coming公司)，轉(zhuǎn)膜夾(北京君意東方電泳設備有限公司)，TGL-168高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，IX51-A12PH 型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和形態(tài)表現(xiàn)觀察 人胃癌SGC 7901細胞培養(yǎng)在含10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于飽和溫度、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。倒置顯微鏡下觀察水飛薊素作用前后SGC 7901細胞形態(tài)表現(xiàn)和生長狀況。

1.3 MTT法檢測各組SGC 7901細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期SGC 7901細胞消化后稀釋成1×105mL-1，每孔200 μL加入96孔培養(yǎng)板中。24 h后，加入含不同濃度(0、15、30和60 mg·L-1)水飛薊素的培養(yǎng)基(每樣設5個復孔)，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，每孔加入MTT溶液100 μL，37℃再培養(yǎng)4 h，充去液體，每孔再加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min。利用酶標儀于490 nm波長處檢測吸光度(A)值，利用公式計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期和細胞凋亡率 取對數(shù)生長期SGC 7901細胞消化后稀釋成1×105mL-1接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，加入含不同濃度水飛薊素(0、15、30和60 mg·L-1)的培養(yǎng)基；培養(yǎng)24 h后，消化，低溫、1 500 r·min-1離心10 min，用PBS洗滌3次，加入70%冷乙醇中，-20℃固定24 h，低溫、1 500 r·min-1離心10 min，用PBS洗滌3次，樣品上機加入0.5 mL碘化丙啶染色液，避光4℃染色30 min。利用ModFit分析軟件進行細胞DNA含量分析，檢測各組細胞周期。利用以下公式計算各組細胞凋亡率，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/(凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù))×100%。

1.5 劃痕實驗檢測各組SGC 7901細胞遷移能力 將密度為1×105mL-1的SGC 7901細胞接種于96孔培養(yǎng)板(包被Matrigel)中，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，形成細胞單層后，沿培養(yǎng)板底部劃“一”字劃痕，測定劃痕區(qū)相對距離，PBS洗滌3次，對照組加含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，水飛薊素組分別加入含15、30和60 mg·L-1水飛薊素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后更換新的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下測量SGC 7901細胞向致傷區(qū)遷移的相對距離，記錄0和48 h相對距離，利用公式計算出細胞實際遷移距離。遷移距離=劃痕后0 h寬度-劃痕后48 h寬度。

1.6 Transwell小室法檢測各組SGC 7901細胞侵襲抑制率 將Transwell小室(包被Matrigel)每孔加入含10 g·L-1BSA的無血清培養(yǎng)液50 μL，37℃放置30 min，置入24孔培養(yǎng)板中，于上室每孔加入含有1×105mL-1細胞的懸液200 μL，于下室加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液600 μL，對照組加含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，水飛薊素組分別加入含15、30和60 mg·L-1水飛薊素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，每組重復4個樣本，常規(guī)培養(yǎng)24～48 h。取出小室，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，臺盼藍溶液染色。倒置顯微鏡下計數(shù)移至微孔膜下層的細胞。

2 結(jié) 果

2.1 各組SGC 7901細胞形態(tài)表現(xiàn) 與對照組比較，30和60 mg·L-1水飛薊素組細胞貼壁密度變小，細胞形態(tài)不規(guī)則、體積變小，產(chǎn)生大量細胞碎片，部分細胞漂浮，且60 mg·L-1水飛薊素組較30 mg·L-1水飛薊素組變化更為明顯，15 mg·L-1水飛薊素組變化不明顯。見圖1。

A：Control group；B-D：15,30,and 60 mg·L-1 silymarin groups.

2.2 各組SGC 7901細胞增殖抑制率和調(diào)亡率 與對照組比較，15、30和60 mg·L-1水飛薊素組SGC 7901細胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)，且60 mg·L-1水飛薊素組增殖抑制率升高最明顯。與對照組比較，不同濃度水飛薊素組細胞主要出現(xiàn)早期凋亡，凋亡率明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組SGC 7901細胞增殖抑制率和凋亡率

Tab.1 Inhibitory rates of proliferation and apoptotic rates of SGC 7901 cells in various groups (n=5,±s,η/%)

*P<0.05 compared with control group.

2.3 各組SGC 7901細胞不同周期細胞百分率 與對照組比較,不同濃度水飛薊素組G0/G1期細胞百分率明顯升高(P<0.05)，而S期和G2/M期細胞比例明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.4 各組SGC 7901細胞遷移和侵襲能力 劃痕48 h后，對照組劃痕變窄，SGC 7901細胞向劃痕內(nèi)部遷移至劃痕區(qū)中部；與對照組比較，水飛薊素15、30和60 mg·L-1組劃痕間隙明顯加寬，細胞遷移距離明顯縮短(P<0.05)。Transwell穿膜實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，15、30和60 mg·L-1水飛薊素組穿膜細胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見圖2、3和表3。

表2 各組不同細胞周期SGC 7901細胞百分率

*P<0.05 compared with control group.

A-D：0 h；E-H：24 h；A，E：Control group；B，F(xiàn)：15 mg·L-1silymarin group；C，G：30 mg·L-1silymarin group； D，H：60 mg·L-1silymarin group.

圖2 劃痕實驗檢測各組SGC 7901細胞遷移能力

Fig.2 Migration abilities of SGC 7901 cells in various groups detected by scratch test

A：Control group；B-D：15,30,and 60 mg·L-1 silymarin groups.

表3 各組SGC 7901細胞遷移距離和穿膜細胞數(shù)

Tab.3 Migration distances and transmembrane number of SGC 7901 cells in various groups (n=5,±s)

*P<0.05 compared with control group.

3 討 論

胃癌的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，患者死亡率高，在我國高發(fā)性消化系腫瘤中占第1位，且就診患者多數(shù)已進入晚期[8-10]。誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌藥物治療腫瘤的重要機制之一[11-13]，臨床抗腫瘤藥物存在不良反應多等缺點。目前探尋治療效果好、不良反應小或無毒的抗胃癌藥物是一個難點。水飛薊素是一種從天然植物水飛薊果實種皮中提取的黃酮木脂素類物質(zhì)[14-15]。研究[16-18]顯示：水飛薊素對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用，但其作用機制仍待進一步研究。因此，本研究以人胃癌SGC 7901細胞作為研究對象，探討水飛薊素抑制人胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用。

細胞大量增殖是腫瘤發(fā)生的一個重要原因，因此，干擾腫瘤細胞生長代謝及增殖過程，誘發(fā)癌細胞凋亡對治療腫瘤具有重要意義[19-20]。本研究結(jié)果表明：不同濃度水飛薊素作用于人胃癌SGC 7901細胞后，細胞貼壁密度變小，細胞形態(tài)不規(guī)則、體積變小，細胞數(shù)量明顯減少，產(chǎn)生大量細胞碎片，SGC 7901細胞增殖活性受到明顯抑制，表明水飛薊素對人胃癌SGC 7901細胞增殖具有抑制作用；人胃癌SGC 7901細胞經(jīng)不同濃度水飛薊素作用24 h后，G0/G1期細胞百分率明顯升高，表明水飛薊素對SGC 7901細胞有周期阻滯作用，周期阻滯于G1期。目前，尚未見有關水飛薊素對人胃癌SGC 7901細胞遷移、侵襲能力影響的研究，本研究結(jié)果顯示：水飛薊素對人胃癌SGC 7901細胞遷移和侵襲能力具有明顯的抑制作用，并呈明顯的量效關系。

綜上所述，水飛薊素對人胃癌SGC 7901細胞具有明顯的增殖抑制作用，可誘導細胞凋亡，進而影響人胃癌SGC 7901細胞的遷移和侵襲能力。本研究僅探討了水飛薊素在體外對人胃癌SGC 7901細胞的作用，但水飛薊素通過何種途徑、何種靶點抑制人胃癌SGC 7901細胞的增殖、遷移、侵襲能力和細胞周期仍待進一步深入研究。