邢樹剛，張麗紅，金明華，李百慧，武則馨，房 波，李 偉

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，吉林 長春130021； 2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗學(xué)教研室，吉林 長春 130021)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，目前主要治療方法是手術(shù)切除輔以放化療。手術(shù)切除后腫瘤常易復(fù)發(fā)，常用的化療藥物有卡莫司汀和替硝唑胺等，上述這些化療藥物雖然取得了一定的治療效果，但由于藥物本身存在的不良反應(yīng)及部分膠質(zhì)瘤的耐藥性，使膠質(zhì)瘤的治療和預(yù)后難以取得理想效果[1-2]，因此尋找更有效且不良反應(yīng)少的藥物成為膠質(zhì)瘤治療的研究重點(diǎn)。楊梅黃酮(Myricetin)是從植物中提取的一種化學(xué)物，其來源廣泛、毒性低、不良反應(yīng)少，并且對基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)具有高效的特異性抑制作用[3-6]。目前已有研究證實(shí)楊梅黃酮對上皮源性惡性腫瘤如食管癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和肝癌等[7-13]以及實(shí)驗動物骨肉瘤[14]均有一定的抑制作用，但其作用機(jī)制目前尚不明確，迄今為止尚無將其應(yīng)用于膠質(zhì)瘤治療學(xué)的研究。本實(shí)驗擬通過體外實(shí)驗研究楊梅黃酮對小鼠腦膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞的抑制作用，為進(jìn)一步闡明其對腦膠質(zhì)瘤的治療作用提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 小鼠膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞由吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室提供；楊梅黃酮購自美國Sigma公司，Matrigel購自美國BD公司，RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，CCK-8 Kit購自日本同仁公司，Hoechst 33342購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin Ⅴ/PI凋亡檢測試劑盒購自天津三箭生物技術(shù)有限公司。

1.2 CCK8實(shí)驗檢測細(xì)胞活性 GL261細(xì)胞選用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的GL261細(xì)胞，以1×105mL-1細(xì)胞密度接種于96孔板中，置37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清液，加入不同濃度楊梅黃酮(濃度梯度為10、20、30、40、50和60 μmol·L-1)，同時設(shè)對照組，各組均設(shè)4個復(fù)孔，分別于24 和48 h各取出一塊培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育1～2 h，觀察培養(yǎng)基顏色變化，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度(A)值，計算每孔細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=處理組A值/對照組A值×100%。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期GL261細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，接種于6孔板，待細(xì)胞融合至80%時，加含40 μmol·L-1楊梅黃酮的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，設(shè)對照組，收取單細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗2次，70%乙醇固定，5 μL RNA酶A(10 g·L-1)，37℃孵育30 min，加入25 μL PI染色液(1 g·L-1)，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.4 Hoechst 33342染色及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，24孔板中每孔加入500 μL單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，取出培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度(30、40和50 μmol·L-1)楊梅黃酮的新鮮培養(yǎng)基，并設(shè)置相應(yīng)的溶劑平行對照。然后加入200 μL Hoechst 33342(1∶2 000稀釋)染液，室溫孵育。熒光顯微鏡下任取5個視野照相，觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)。凋亡的細(xì)胞核固縮、深染，核內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的GL261細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106mL-1，接種于6孔板，待細(xì)胞融合至80%時，加入含有不同濃度(0、30、40和50 μmol·L-1)楊梅黃酮的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，Annexin Ⅴ-FITC與PI匹配標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。凋亡結(jié)果判斷：正?；罴?xì)胞AnnexinⅤ(-)、PI(-)；早期凋亡細(xì)胞AnnexinⅤ(+)、PI(-)；晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞AnnexinⅤ(+)、PI(+)。細(xì)胞凋亡率=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期或壞死細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力 GL261細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，將小室放入24孔板中，接種50 μL單細(xì)胞懸液，并用無血清培養(yǎng)基將體積補(bǔ)充至200 μL，分別在上室和下室加入楊梅黃酮(0、5、10和20 μmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，下室面細(xì)胞甲醇固定20 min，PBS清洗，置于含有0.1%結(jié)晶紫的孔中染色15～20 min，倒置顯微鏡觀察，于400倍視野下任取5個不重復(fù)視野照相并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 將Matrigel至4℃冰箱預(yù)溶解，無血清培養(yǎng)基1∶3稀釋，混勻后60 μL每孔加至小室上室聚碳酸酯膜(孔徑8 μm)，37℃孵育30 min，取對數(shù)生長期的GL261細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，將小室放入含有10%血清及新鮮培養(yǎng)基的24孔板中，接種單細(xì)胞懸液，分別在上室和下室加入楊梅黃酮(0、5、10和20 μmol·L-1)，12 h后下室面細(xì)胞甲醇固定20 min，PBS清洗，置于含有0.1%結(jié)晶紫的孔中染色15～20 min，倒置顯微鏡下觀察，于400倍視野下任取5個不重復(fù)視野照相并計數(shù)。

1.8 RT-PCR法檢測MMP-2、MMP-9和MMP-14 mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取楊梅黃酮(0、5和10 μmol·L-1)處理的GL261細(xì)胞總RNA，核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min。PCR引物序列：GAPDH 正義鏈，5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′， 反義鏈，5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′； 小鼠MMP-2 正義鏈，5′-CAAGTTCCCCGGCGATGTC-3′， 反義鏈，5′-TTCTGGTCAAGGTCACCTGTC-3′； MMP-9 正義鏈，5′-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3′， 反義鏈，5′-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3′； MMP-14 正義鏈，5′-CAGTATGGCTACCTACCTCCAG-3′， 反義鏈，5′-GCCTTGCCTGTCACTTGTAAA-3′。PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性3 min；94℃、30 s，55℃～60℃、30 s，72℃、30 s，32個循環(huán)；72℃終延伸10 min；1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察各條帶并照相，利用凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組GL261細(xì)胞的存活率 20、30、40、50和60 μmol·L-1楊梅黃酮組在24和48 h時細(xì)胞存活率較對照組均明顯下降(P<0.01)，且呈時間-劑量依賴性。見表1。

表1 各組GL261細(xì)胞存活率

*P<0.01 compared with control group.

2.2 各組GL261細(xì)胞的細(xì)胞周期 與對照組比較，40 μmol·L-1楊梅黃酮組GL261細(xì)胞G1期比例升高(P<0.05)，S期比例降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組GL261細(xì)胞周期

2.3 各組GL261細(xì)胞凋亡情況 Hoechst 33342染色結(jié)果：與對照組比較，楊梅黃酮組GL261細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)改變，出現(xiàn)凋亡小體。并且隨藥物濃度的增加，凋亡小體的比例也隨之增加，見圖2(插頁二)。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ/PI熒光雙染法檢測楊梅黃酮對GL261細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。與對照組比較，30、40和50 μmol·L-1楊梅黃酮組早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例均增加(P<0.05或P<0.01)，并且隨藥物濃度的增加，晚期凋亡的細(xì)胞比例有增加的趨勢。見圖3和4。

A：Control group；B-D：30,40,and 50 μmol·L-1 myricetin groups.

*P<0.05，**P<0.01 compared with 0 mol·L-1Myricetin.

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組GL261細(xì)胞凋亡率

Fig.4 Apoptotic rates fo GL261 cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各組GL261細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)目和侵襲率 與對照組比較，5、10和20 μmol·L-1楊梅黃酮組GL261細(xì)胞遷移率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，并隨楊梅黃酮濃度的增加，GL261細(xì)胞遷移率呈遞減的趨勢，見圖5(插頁二)和圖6。進(jìn)一步通過包被Matrigel的 Transwell小室檢測GL261細(xì)胞的侵襲能力，與對照組比較，楊梅黃酮組GL261細(xì)胞侵襲率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且隨著楊梅黃酮濃度的增加，GL261細(xì)胞侵襲率逐漸減少。見圖7(插頁三)和圖8。

*P<0.05**P<0.01 vs 0 μmol·L-1 myricetin(control) group.

2.5 各組GL261細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和MMP-14 mRNA表達(dá)水平 與對照組比較，楊梅黃酮5和10 μmol·L-1組MMP-2與MMP-9 mRNA的表達(dá)水平均降低(P<0.05或P<0.01)，MMP-14 mRNA表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。見表2和圖9。

3 討 論

楊梅黃酮廣泛存在于自然界的各種植物中，已有研究證實(shí)其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)元和抑制血栓形成等多種功能[15-20]。近年來楊酶黃酮在腫瘤治療中的作用越來越引起研究者的關(guān)注。目前已有研究[7-10]證實(shí)：楊梅黃酮對肺癌、肝癌、食管癌和皮膚癌等均有一定的治療作用，但其在腦膠質(zhì)瘤中的作用及其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

*P<0.05，**P<0.01 vs 0 μmol·L-1 myricetin(control group).

Lane 1,4,7,10: 10 μmol·L-1myricetin group;Lane 2,5,8,11: 5 μmol·L-1myricetin group;Lane 3,6,9,12: Control group;M:Marker.

圖9 各組GL261細(xì)胞中MMPs mRNA表達(dá)電泳圖

Fig.9 Electrophoregram of MMPs mRNA expressions in GL261 cells in various groups

表2 各組GL261細(xì)胞中MMPs mRNA表達(dá)水平

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

促進(jìn)增殖和抑制凋亡是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖的2個重要因素。為研究楊梅黃酮對膠質(zhì)瘤增殖和凋亡的影響，本研究首先應(yīng)用CCK-8實(shí)驗以及流式細(xì)胞術(shù)檢測楊梅黃酮對膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261增殖的影響，結(jié)果顯示：楊梅黃酮能抑制GL261細(xì)胞的活性，并呈時間-劑量依賴性；細(xì)胞周期分析證實(shí)楊梅黃酮通過將細(xì)胞周期阻滯于G1期抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分裂增殖；通過Hoechst 33342 染色形態(tài)學(xué)觀察可見楊梅黃酮可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡小體增多；流式細(xì)胞術(shù)對早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示：楊梅黃酮可增加細(xì)胞凋亡率。由以上結(jié)果本文作者推測：楊梅黃酮對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用通過抑制增殖和促進(jìn)凋亡雙重機(jī)制來完成。有研究[12]顯示：楊梅黃酮可將肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，并證實(shí)其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制可能是通過線粒體凋亡途徑以及Akt/p70s6k1/Bad信號通路進(jìn)行的；有研究[13]還顯示：楊梅黃酮通過降低ERK1/2以及Cycline D1的水平將細(xì)胞周期阻滯于G1期。Maggioni等[7]的研究也證實(shí)：楊梅黃酮可通過下調(diào)鱗狀細(xì)胞癌SCC-25細(xì)胞Cycline D1的表達(dá)將細(xì)胞周期阻滯于G1期。上述研究結(jié)果與本實(shí)驗結(jié)果一致，并為本課題組進(jìn)一步研究楊梅黃酮調(diào)控膠質(zhì)瘤增殖和凋亡的相關(guān)信號通路及其機(jī)制提供一定理論依據(jù)。

惡性腫瘤的一個重要生物學(xué)特征是局部浸潤和轉(zhuǎn)移，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MMPs是目前已知的能降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶。本文作者通過酶動力學(xué)實(shí)驗證實(shí)楊梅黃酮對MMP-2、MMP-9和MMP-14具有特異性抑制作用。本研究首先利用Transwell小室檢測GL261細(xì)胞在楊梅黃酮作用下的遷移及侵襲能力，結(jié)果顯示：楊梅黃酮可抑制 GL261細(xì)胞的遷移；進(jìn)而在Transwell小室內(nèi)包被Matrigel用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，結(jié)果表明：楊梅黃酮可降低穿透Matrigel的細(xì)胞比例，因此本文作者認(rèn)為楊梅黃酮可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。

為進(jìn)一步明確楊梅黃酮是否通過抑制MMPs從而降低GL261細(xì)胞的遷移及侵襲能力，本研究應(yīng)用RT-PCR法檢測MMP-2、MMP-9和MMP-14 mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果表明：在楊梅黃酮的作用下，GL261細(xì)胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平明顯降低。MMP-2和MMP-9又稱明膠酶、Ⅳ型膠原酶，其主要功能是降解基底膜的主要成分Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ膠原，腫瘤細(xì)胞的基底膜是腫瘤的天然組織學(xué)屏障，基底膜降解是腫瘤侵襲的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21-22]。有研究[8]顯示：楊梅黃酮可抑制肺癌A549細(xì)胞 MMP-2的表達(dá)及活性。Jung等[5]通過應(yīng)用楊梅黃酮治療經(jīng)紫外線照射的小鼠發(fā)現(xiàn)：楊梅黃酮可抑制紫外線誘導(dǎo)的MMP-9的表達(dá)及酶活性。由此本文作者認(rèn)為：楊梅黃酮可通過降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及侵襲。MMP-14屬膜型基質(zhì)蛋白酶，又名MT1-MMP，其在惡性腫瘤進(jìn)展及腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用[23]。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)楊梅黃酮處理后MMP-14 mRNA的表達(dá)無明顯影響，提示其在楊梅黃酮促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲中未發(fā)揮作用。

綜上所述，楊梅黃酮可在體外抑制小鼠膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，并通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。上述作用的相關(guān)信號通路、機(jī)制以及楊梅黃酮在膠質(zhì)瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用有待進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗研究證實(shí)。